异种egfr胞外区重组dna疫苗和蛋白质疫苗的制备与抗小鼠肿瘤作用的研究 (1)

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1、中文摘要摘要表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)是原癌基因c-erbB基因编码的170kDa跨膜糖蛋白，具有胞内酪氨酸激酶活性。由于在多种上皮恶性肿瘤中，EGFR都发生一定程度的突变或异常高表达，且与肿瘤患者的不良预后密切相关。因此，EGFR是一种肿瘤的标志性抗原，可将其作为肿瘤治疗的靶点之一。本研究首次将鸡源EGFR(cEGFR)胞外Ⅱ．ⅡI区作为抗原，免疫球蛋白IgG-Fc片段作为疫苗载体分子与cEGFR片段融合，构建了重组DNA疫苗和蛋白质疫

2、苗，评价这两种疫苗在小鼠Lewis肺癌模型中的抗肿瘤主动免疫疗效，探讨其抗肿瘤作用机制。我们用重叠延伸PCR法扩增获得cEGFR-Fc融合基因，克隆至pVAXl质粒构建重组DNA疫苗pVAXl．cEGFR．Fc，同时，构建载有溶葡球菌酶信号肽序列的pET-28a(+)．S公用分泌型大肠杆菌表达载体，将cEGFR-Fc融合基因克隆至该载体，并转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达的融合蛋白cEGFR-Fc经ProteinA亲和层析纯化后作为蛋白疫苗。48只C57BL／6J小鼠随机平分为4组：

3、单用DNA疫苗组、单用蛋白质疫苗组、DNA疫苗和蛋白疫苗联合免疫组及生理盐水对照组，各组小鼠免疫4次后接种Lewis肺癌细胞，观测肿瘤生长情况及小鼠生存状态及毒副反应。19天后脱颈椎处死小鼠，剥离肿瘤称重并计算抑瘤率。Westernblot法检测小鼠血清中是否产生了抗EGFR抗体，ELISA法检测抗体滴度。分离免疫小鼠脾脏细胞，检测淋巴细胞对靶细胞A431的细胞毒性作用。本研究成功构建了重组质粒pVAXI-cEGFR—Fc和pET28a(+)一S·cEGFR-Fc，其中，pET28a(+)．S．cE

4、GFR-Fc转化大肠杆菌后，经诱导表达在发酵上清液中获得了30---35％分泌蛋白，经ProteinA亲和层析纯化，得到纯度达85％以上的重组融合蛋白。动物实验结果表明，三疫苗组小鼠肿瘤明显小于生理盐水对照组俨<0．01)，联合免疫组小鼠肿瘤亦明显小于DNA疫苗组、蛋白疫苗组(P

5、受体高表达的A431细胞具有杀伤作用，效靶比为10：1时具有最大杀伤率。本研究证实，异种同源EGFR胞外II一Ⅲ区重组DNA疫苗和蛋白质疫苗能打破机体对自身EGFR分子的免疫耐受，产生特异性免疫反应，对小鼠lewis肺癌有明显的抑制作用。两种疫苗的联合使用可进一步加强抑瘤作用。复旦大学硕士学位论文异种EGFR胞外区重组DNA疫苗与蛋白质疫苗的制各及抗小鼠肿瘤作用研究关键词：肿瘤；表皮生长因子受体；DNA疫苗；蛋白质疫苗；Fe融合蛋白；分泌表达；抗肿瘤主动免疫治疗中图分类号：R730．3；R730．5

6、12英文摘要AbstractEpidermalgrowthfactorreceptor(EGFR)isa170kDatransmembraneglycoprotein、7lritllintrinsictyrosinekinaseactivityencodedbytheoncogenec-erbB．MutationandoverexpressionofEGFRarecommoninmanyhumanepithelialtumols，whichhavebeencorrelated谢tllbadprogn

7、osis．TheconstitutiveactivationoftheEGFRsignalpathwayCandrivecancercellproliferation,invasionandsurvival．Therefore，EGFRCallbeconsideredasatumor-associatedantigen(TAA)andbecomeallattractivetargetforcancertherapy．Inthisstudy,WeconstructedaDNAvaccineandapr

8、oteinvaccinebasedonregionII—HIofxenogeneicextracellulardomainofEGFR(EGFR-ECD)fused、^，ithFeportionofIgG(IgG-Fc)．Theiractiveanti-tumorimmuneeffectsonmouseLewislungcancerwereevaluated．cEGFR-FcrecombinantgeneWasamplifiedbySplicingbyovedapex