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《异种vegf融合蛋白疫苗对小鼠lewis肺癌的抑制作用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、异种VEGF融合蛋白疫苗对小鼠Lewis肺癌的抑制作用作者：刘倩,唐亮,李英辉,周彩存,谈立松,赵玉军,张培德,张尚权【摘要】 目的:利用原核表达系统,构建异源血管内皮生长因子融合蛋白疫苗,研究该融合蛋白疫苗对小鼠Lewis肺癌肿瘤模型的抗血管生成主动免疫治疗效果。方法:将鸡VEGF基因克隆入pGEX-4T-2原核表达载体,经IPTG诱导融合蛋白表达,Ni-NTA纯化,透析复性,构建GST-cVEGF融合蛋白疫苗。将C57BL16J小鼠随机分为3组,GST-cVEGF疫苗组10只、cVEGF疫苗组10只、生理盐水组(NS)10只
2、。将各组样品与等体积弗氏佐剂混合,各组小鼠每只分别0、2、3周免疫100μgGST-cVEGF融合蛋白疫苗、单纯cVEGF蛋白疫苗、生理盐水。接种Lewis肺癌细胞,观察肿瘤的生长情况和小鼠状态。接种肿瘤18d后,处死小鼠,剥离肿瘤称重。检测小鼠血清中特异性抗VEGF抗体滴度。结果:GST-cVEGF疫苗组、cVEGF组、生理盐水组肿瘤均重分别为(1.55±0.534)g、(1.93±0.607)g、(2.87±0.642)g。GST-cVEGF疫苗组肿瘤重量明显小于生理盐水组(P<0.01)。疫苗组血清产生抗VEGF抗体滴
3、度为1∶2000。结论:异种血管内皮生长因子基因重组融合蛋白疫苗可干扰机体对自身VEGF的免疫耐受,可产生较高水平的特异性抗VEGF抗体,并具有抑制小鼠Lewis肿瘤生长的效应。12【关键词】血管内皮生长因子融合蛋白疫苗肿瘤/免疫治疗小鼠 肿瘤的生长、转移及其预后依赖于血管生成。血管内皮生长因子(vascularendothdialgrowthfactor,VEGF)是迄今发现最重要的血管生成因子之一［1］。近年来以VEGF及其受体(vascularendothelialgrowthfactorreceptor,VEGFR)作为
4、靶分子的抗肿瘤新药研发取得了很大的进展,已经有数个药物经美国FDA批准上市。重组人源化的鼠单克隆抗体（mAb）Avastin［2］,可有效地抑制多种人类肿瘤细胞移植瘤的生长,高亲合力地结合VEGF,可直接阻断VEGF通过VEGFR的信号表达。本研究中,我们构建了谷光甘肽硫转移酶（GST）与鸡源VEGF(cVEGF)融合基因的原核表达重组质粒,在大肠杆菌中进行蛋白质诱导表达,并对表达产物进行分离纯化及复性,再进一步研究该融合蛋白疫苗对小鼠Lewis肺癌肿瘤模型的抗血管生成主动免疫治疗效果。 1材料和方法 1.1材料质粒抽提试剂盒
5、、胶回收试剂盒、各种限制性核酸内切酶、ExTaq酶、T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司;弗氏完全佐剂,不完全佐剂购自Sigma公司;12重组人VEGF165抗原购自美国PeproTechEC公司;山羊抗小鼠IgG-HRP购自SantaCruz公司;96孔酶标板NUNC公司产品;次氮基三乙酸镍琼脂糖(Ni-NTA)和蛋白质分离纯化柱购自Qiagen公司;小鼠Lewis肺癌细胞株由本实验室保存;4周龄C57BL/6J小鼠（♀）购自中国科学院上海生化细胞研究所。 1.2方法 1.2.1VEGF基因克隆及原核表达载体的构建为了利于
6、表位之间以及表位与蛋白之间的融合,在GST的基因序列与cVEGF基因序列之间引入6个Gly的柔性接头序列,并在下游引入HIS-Tag基因序列以便于对表达产物进行分离纯化,设计带EcoRI-XhoI酶切位点的引物PrimerI(由上海赛百盛基因技术有限公司合成):上游:5′-GCGAATTCCGGGCGGTGGCGGTGGCGGTAACTTTCTGCTCACTTGGATC-3′。下游:5′-GC-CTCGAGCTCAGTGATGGTGATGGTGATGCCGTCTCGGTTTTTCACA-3′。以pMD18-T-cVEGF质粒（本实
7、验室保存）为模板,PCR扩增,条件为:94℃变性4min;94℃30s,58℃30s,72℃1min,共30个循环;最后72℃延伸10min。PCR产物经酶切回收连接至pGEX-4T-2原核表达载体,并转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。PCR和双酶切鉴定,并进行测序鉴定(捷瑞生物工程(上海)有限公司测部)。 1.2.2融合蛋白的诱导表达及分离纯化挑取阳性菌株,在终浓度为0.8mmol/L的IPTG诱导表达。分别收取诱导前后标本,12超声破菌,作聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。大规模诱导培养菌体,将所得包涵体经洗涤液
8、（含5g/LTritonX-100,10mmol/LEDTA,pH8.0)反复洗涤3次,再分别用2mol/L,4mol/L尿素洗涤3次,变性溶解在含10mmol/L巯基乙醇的8mol/L尿素中,按Qiagen公司方法,采用Ni-NTA亲和层析柱分离
