hsp65-muc1肿瘤疫苗、hiv+dna疫苗和hiv重组痘病毒疫苗的临床前毒理学研究

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1、第四军医大学博士学位论文HSP65-MUC1肿瘤疫苗、HIVDNA疫苗和HIV重组痘病毒疫苗的临床前毒理学研究姓名：霍艳申请学位级别：博士专业：生物化学与分子生物学指导教师：王军志20070501独创性声明秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在

2、论文中作了明确的说明并表示了致谢。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：日期：保护知识产权声明本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。学校可以公布论文的全部或部分内容（含电子版，保密内容除外），可以采用影印，缩印或其他复制手段保存论文。学校有权允许论文被查阅和借阅，并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。论文作者签名：导

3、师签名：日期：第四军医大学博士学位论文HSP65-MUC1肿瘤疫苗、HIVDNA疫苗和HIV重组痘病毒疫苗的临床前毒理学研究博士研究生：霍艳导师：王军志研究员中国药品生物制品检定所国家药物安全评价监测中心，北京100176中文摘要疫苗是使用最广泛的药物之一，不仅使天花、疟疾等某些烈性传染病得到有效的控制或消灭，而且还被应用于肿瘤、自身免疫病、免疫缺陷、超敏反应等疾病的预防和治疗。新型疫苗是采用基因工程技术和生物化学合成技术生产的，包括裸DNA疫苗、重组蛋白类疫苗、合成肽疫苗、重组病毒和细菌疫苗等。

4、我国一直未要求对疫苗类药物进行全面的临床前毒理学研究，国际上对于疫苗的临床前安全性研究也处于探索阶段。采用何种方法研究疫苗的毒性，特别是免疫毒性一直是困扰人们的课题。为解决我国不断研制的新型疫苗在进入临床和市场前的安全性研究问题，本文选择了我国独立研发的具有自主知识产权的三种新型疫苗—热休克蛋白－多肽复合物肿瘤疫苗（重组热休克蛋白65－MUC1融合蛋白肿瘤疫苗，HSP65-MUC1）、HIVDNA疫苗（DNA疫苗）和HIV重组痘病毒载体疫苗（痘苗）作为研究对象（其中，包括以DNA疫苗和重组痘病毒载

5、体HIV疫苗组成的复合疫苗），对其进行了免疫毒性、一般毒性以及DNA疫苗和病毒载体疫苗的生物分布研究，目的是为找出不同疫苗毒理学研究中的共性问题及特性问题，建立相应的研究方法和研究体系。在本研究采用的免疫毒性检测的方法包括：（1）免疫相关组织器官的宏观和微观病理学检查；（2）非放射性CFSE染色法检测淋巴细胞功能（3），巨2第四军医大学博士学位论文噬细胞功能检查（4）流式细胞法对不同亚型淋巴细胞数量的测定（5）ELISA检测体液免疫；（6）ELISA法、细胞内染色法、ELISPOT法检测T细胞免疫

6、（细胞因子的产生）。本研究对DNA疫苗和病毒载体疫苗建立了实时定量PCR法检测其DNA生物分布。一般毒性研究检测疫苗对机体本身的宏观毒性反应，方法包括：血液学和血清生化学检查、大体和组织病理学检查、体重、摄食量、临床症状的观察等。HSP65-MUC1毒性的研究包括：C57BL/6小鼠单次给药毒性研究、C57BL/6小鼠反复给药毒性研究、恒河猴反复给药毒性研究。以临床研究拟用给药次数为“n”，小鼠试验采用“n＋1”次给药，恒河猴采用“n＋4”次给药。研究内容包括免疫毒性和一般毒性。DNA疫苗的研究包

7、含在复合疫苗的毒性研究中，采用BALB/c小鼠反复给药研究，完全模拟临床“3针DNA疫苗prime－1针病毒载体疫苗boost”的给药方案。研究内容包括免疫毒性、一般毒性和生物分布研究。痘苗毒性研究采用BALB/c小鼠，采用“n”次给药和“n＋1”次给药2种组合，研究内容包括免疫毒性、一般毒性和生物分布研究。本研究中3种疫苗主要的毒性研究结果为：（1）在小鼠和恒河猴未见与HSP65-MUC1有关的全身毒性反应和免疫毒性反应；HSP65-MUC1可以诱导较强的体液免疫和细胞免疫反应。（2）DNA疫苗

8、和痘苗的毒性反应包括主要由痘苗引起的注射部位可逆性的局部刺激反应、以及部分血液学指标可逆性的变化；复合疫苗与两种组分分别单独使用相比，可以诱导较强的体液和细胞免疫反应。（3）组织分布研究发现DNA疫苗和痘苗在体内不会广泛分布、也不会长期残留。本研究初步建立了关于疫苗毒理学研究的主要方法和研究体系，包括（1）建立了疫苗免疫毒性检测的方法和体系：免疫相关组织器官的宏观和微观病3第四军医大学博士学位论文理学检查；建立了非放射性CFSE染色法检测淋巴细胞功能的方法，采用亚型测定检测淋巴细胞