ph响应性透明质酸纳米抗癌药物载体的研究

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1、嬲黜幽pH响应性透明质酸纳米抗癌药物载体的研究指导教师答字．砌恳杰J答辩委员会成员签字：‘後易oI／旷’y≥溢锄气；轰--d孤珙。南们们撕欤，又独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：寻噘弗签字日期：杪f口年孓月)；日学位论文版权使用授权书本学位

2、论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文袭查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行捡索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：导师签字：叫黼签字日期：年月13签字日期：710年户月锣El中文摘要本论文以组氨酸为疏水和pH相应性基团，制备了透明质

3、酸．组氨酸化学耦合物(Hyaluronicacid．Histidine，HH)，研究了这种两亲性分子在水溶液中的自组装行为；以阿霉素(Adriamycin，ADR)为模型药物制备了载药的透明质酸纳米粒，研究了其在生理pH值7．4和酸性pH值6．0介质中的药物释放效果；以人乳腺癌细胞系(humanbreast-cancercellline，MCF．7)细胞为模型细胞，考察了载药纳米粒的体外肿瘤细胞杀伤率，并探讨了纳米粒对内涵体pH值的响应性以及载药纳米粒在细胞内释放药物的情况。利用EDC作为交联剂，通过酰胺键共价连接组氨酸(H

4、istidine，His)到透明质酸(Hyaluromcacid，HA)上制备透明质酸一组氨酸耦合物化学耦合物，并改变组氨酸与透明质酸的反应摩尔比制成三种不同取代度的样品(HH5、HH9、HHl0)。通过酸碱滴定试验得到了透明质酸一组氨酸耦合物的滴定曲线；利用核磁共振检测对其结构进行表征，证明了化学耦合成功，通过特征峰积分法得到产物的取代度；超声制备HH纳米粒，利用荧光光谱法测定纳米粒的临界聚集浓度(CAC)，发现HH纳米粒的CAC随着取代度的增加而降低，三种样品的CAC值分别是：0．098mg／ml、0．045mg／ml、

5、0．039mg／ml；内核的疏水性随取代度的增加而提高；利用动态激光散射研究了纳米粒的粒径及其对介质pH值的响应性，在生理pH值7．4的缓冲溶液中，纳米粒的粒径随取代度增加而降低，最小为342nm，而当介质的pH值降为6．0时，透明质酸．组氨酸聚集体的粒径已经超出纳米级尺寸，而处于微米级的范围内，该结果显示出HH纳米粒可对酸性pH值环境作出响应；利用透射电子显微镜和扫描电子显微镜技术对纳米粒的形态进行了表征，纳米粒近似球形，形态完整。以阿霉素为模型药物，利用疏水相互作用，以最初加药量为10wt．％的比例，超声制各了载药HH9

6、纳米粒，其载药量为：7．02％；包封率为：87．23％。探讨了载药HH9纳米粒的体外释药性能，在生理pH值7．4的介质中，48d,时内累计释药百分率为27．98％，而当介质的pH值下降到内涵体的酸性pH值6．0时，6小时内的累计释药百分率就达到28．33％，48小时内累计释药百分率高达50．97％。此结果显示了载药纳米粒对pH值变化的响应性，即当pH值降到6．0时，组氨酸发生质子化作用，纳米粒内部失去了疏水和亲水作用力间的平衡，原本稳定的核．壳结构被破坏，极大地加速了阿霉素的释放。本文还用MTT比色的方法研究了HH9纳米粒的

7、细胞毒性和载阿霉素HH9纳米粒对肿瘤细胞杀伤的有效性，并利用荧光显微镜检测了细胞对载阿霉素HH9纳米粒、荧光标记的HH9纳米粒和荧光标记的载阿霉素HH9纳米粒的内吞作用以及载药HH9纳米粒向细胞质中释放阿霉素的情况。结果表明，空[刍HH9纳米粒对MCF．7细胞无显著毒性，孵育3天存活率仍在95％以上；与阿霉素注射剂相比，在1pg／ml、599／ml和1099／ml时，HH9载药纳米粒显示出更高的细胞毒性；荧光显微镜观测结果显示，MCF．7细胞对HH9纳米粒和载阿霉素HH9纳米粒的内吞作用具有时间依赖性；在4h内载阿霉素HH9

8、纳米粒可以将其包埋的阿霉素释放到细胞质中。关键词：纳米粒；透明质酸；组氨酸；pH响应性；阿霉素；内吞作用；}ThestudyofpH—responsivenanoparticlesbasedonhyaluronicacidasdrugdeliverysystemAbstractHydrop