截短β连环素对人胚肺成纤维细胞的作用及机制的研究

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1、中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：—三立垒蜇』日期：三旦划中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工

2、作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科'大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文．论文作者签名：盔丝指导教师签名：查笪垒堡日期：鱼删·中文论著摘要·截短B连环素对人胚肺成纤维细胞作用及机制的研究目的间质住肺疾病(InterstitialLungDisease，ILD)近年来发病率和死亡率呈明显上升趋势，晚

3、期肺纤维化是共同结局。该疾病发病率为3-6／10万，其中50％的IPF病人在确诊后4-5年死亡，死亡率与肺癌相似，严重威胁人群健康和影响生活质量。因此，积极研究肺纤维化发生机制，探索防治肺纤维化新途径，已成为肺科学界研究的热点和难点。尽管肺纤维化发病机制目前尚不完全清楚，但随着细胞生物学和分子生物学研究不断深入，对肺纤维化的发生、发展机制有了许多新得认识，肺纤维化机制的研究正逐渐走向整体化和多学科交叉方向。Wnt信号途径是发育生物学中的重要信号分子，它在哺乳动物肺脏发育中起重要作用。基因敲除实验证实：Wnt2a基因敲除鼠没有发育出肺脏的轮廓；Wn

4、t5a基因敲除鼠在肺脏发育后期无法最后完成肺脏成熟，小鼠因此而死亡。许多证据表明B—catenin(B一连环素)活化促进纤维化疾病的发生。侵袭性纤维瘤病是一种良性克隆性纤维细胞增生疾病，在散发病人的组织病理切片中发现p-catenin向细胞核内浓聚，即向核内转移启动下游基因转录。文献报道IPF病人受损支气管基底细胞和损伤部位II型上皮细胞中发现B—catenin向细胞核内转移。肺纤维化研究发现Wnt信号下游效应基因一潮P．7直接参与了肺纤维化的发生、发展。Writ／§-catenin信号和TGF一8通路存在多个环节相连通，TGF-口(转化生长因子

5、B，TGF-B)可以直接激活TCF／LEF(Tcellfactor／lymphoidenhancerfactor，TCF／LEF)转录目的基因。因此，本课题拟利用基因转染、RT—PcR(reversetranscriptionPeR，RT-PCR)和蛋白印迹(WesternBlotting，WB)等实验技术探讨p．-catenin对成纤维细胞有何作用及作用机制。方法利用eDNA文库经PCR扩增获得人截短betacatenin基因，构建质粒SCAT--pcDNA3．0：利用Sofast转染试剂将SCAT--pcDNA3．0质粒转染入人胚肺成纤维细胞

6、(HELF)，收集细胞分别在mRNA和蛋白水平观察如下指标：游走性，胶原I、Ⅲ合成量，a平滑肌肌动蛋白、上皮钙粘连蛋白、MMP-7合成状态。结果分析以电泳条带上灰度值作为表达产物水平的参数。应用SPSSIO．0统计分析软件对实验数据进行统计分析。显著检验水准a值取0．05。结果用KpnI和XhoI双酶切PCR产物并回收该片段。将该片段连接到同样被KpnI和XhoI双酶切的pcDNA3．0载体中，转化大肠杆菌DH5Ⅱ感受态细菌，挑取阳性克隆进行质粒提取，进行酶切鉴定，并获得阳性克隆。重组质粒测序分析结果与Genebank内B-catenin序列比较

7、，结果表明没有错配。使用转染试剂Sofast将构建成功表达质粒、pcDNA3．0质粒及对照质粒pEGFP-NI转染入人胚肺成纤维细胞，倒置荧光显微镜下观察对照组出现绿色荧光。RT—PCR及WesternBlot检测B—catenin及新霉素抗性基因表达显示：正常细胞及转染空质粒细胞有少量6-catenin表达，而转染SCAT--pcDNA3．0质粒的HELF细胞有强烈的t3-catenin表达；新霉素抗性基因在HELF细胞中无表达，但在转染空载体和转染SCAT--pcDNA3．0质粒的HELF细胞中有较强的表达。转染SC^T--pcDNA3．OH

8、ELF细胞合成胶原I较HELF细胞及转染空载体细胞增加，而胶原Ⅲ的合成在转染空载体细胞及HELF细胞有较小区别，但在转染重组质粒细胞中有