ing4基因重组表达及抗肿瘤效应的实验的研究

《ing4基因重组表达及抗肿瘤效应的实验的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、m日基因重组表达及抗肿瘤效应的实验研究中文摘要NG4基因重组表达及抗肿瘤效应的实验研究中文摘要目的：先从小鼠肝组织中克隆ING4基因并构建真核表达载体pcDNA3．0一ING4，研究ING4对人肝癌SMMC7721细胞、人宫颈癌Hela纽亳、人胃癌SGC7901细胞的作用；再构建原核表达载体pET-21a(+)．ING4并表达纯化和制各多克隆抗体。方法：采用RT-PCR技术从小鼠肝组织中克隆ING4基因，将其构建至pUCm—T载体上，经测序鉴定正确后，再构建重组表达质粒pET-21a(一)一ING4和p

2、cDNA3．0．ING4，采用PCR、双酶切和基因测序鉴定。(1)利用阳离子脂质体Lipofectamine分别将pcDNA3．0一ING4转入COS-7细鱼、人肝癌SMMC7721细胞、人宫颈癌Hela细胞、人胃癌SGC7901细毫。然后分别用RT-PCR、流式细胞仪、激光扫描关聚焦显微镜及Hoechst33258核染色等方法鉴定ING4基因的表达和研究其对几种肿瘤细堕的抑制作用，同时还将ING4和n．24对SMMC7721细胞的作用进行匕较。(2)用氯化钙法将重组质粒pET-21a(+)一ING转化

3、大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG诱导表达，用SDS—PAGE凝胶电泳检测ENG4蛋白表运情况。ING4原核表达产物经初步纯化后，免疫家兔制备多克隆抗体。结果：RT-PCR扩增的产物经1．2％琼脂糖凝胶电泳后，可见750bp大小自jDNA片段，与理论预测结果相符，测序结果与GenBank报道的序列相比，除有一个碱基发生同义突变外其余均一致，原核和真核重组表达ING彳基因重组表达及抗胖蓿效旦拘实验研究中文摘要质粒构建正确。结果显示ING4基因不仅可在COS．7和多种肿瘤细胞(人肝癌SMMC7721细胞

4、、人宫颈癌Hela细胞、人胃癌SGC7901细胞)中表达，而且具有诱导这些肿瘤细胞凋亡的作用。同时研究表明IL一24也具有促使肿瘤SMMC7721细胞凋亡的作用。原核表达产物经SDS．PAGE凝胶电泳检测出现30kD左右的条带，与预测目的条带大小接近，兔抗鼠多克隆抗体制各成功。结论：该基因系国内首次获得并经序列测定证实的小鼠1NG4基因。为进一步研究ING4基因抗肿瘤的分子机制及开发具有自主知识产权的基因治疗载体奠定了实验基础。关键词：ING4；凋亡；真核表达：原核表达II作者：王金志指导老师：杨吉成教

5、授Theexperimentalstudyonrecombinantexpressionandanti．tumoreffectofING4AbstractObjective：(1)ToconstructpeDNA3．0一ING4recombinanteukaryoticexpressionplasmidandexploretheeffectofING4onsomekindsoftumourcells；(2)ToconstructpET-21a(+)recombinantprokaryoticexpres

6、sionplasmidandpreparethepolyclonalantibodyMethods：UsingRT-PCRmethod，thecDNAencodingthemouseING4wasisolatedwithtotalRNAextractedfrommouselivertissue．(1)ThecDNAfragmentXVS5clonedintotheeukaryoticexpressionplasmidpcDNA3．0．ING4，AnalysisofPCR、restrictionenzym

7、edigestionandDNAsequencingwerecarriedouttodemonstratethesequenceoftheplasmid，ThenWetransfecteditintosomekindsoftumurcellsbyLipofectaminetostudytheexpressionandthefunctionofING4；(2)ThecDNAfragmentwasclonedintotheprokaryoticexpressionplasmidpET-21a(+)．Anal

8、ysisofPCR?restrictionenzymedigestionandDNAsequencingl{’erecarriedouttodemonstratethesequenceoftheplasmid，ThenthepET-21a(+)-ING4wastransformedintoE．eoliBL21(DE3)，recombinantproteinwasexpressedinE．colihoststrainBL21(DE3)inth