表达分泌型stβrⅱ胞外区-rantes融合基因重组腺病毒构建及抗肿瘤作用实验的研究

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1、天泮医科人学博士学位论文APCbpcDNACARCTLCVLDCDNADNasedNTPELISAGM．CSFILIFNkbmRNANF—kBODPBMCPBS缩略语AbbreviationantigenpmsemingcellsbasepaircomplementaryDNAcoxsackieadenovirusreceptorcytotoxicTlymphocytescrudevirallysatedendriticcelldeoxyribonucleicaciddeoxyribonucleasedeoxyribonucleosidetriphosp

2、hateenzyme-linkedimmunosorbentassaygranuloeytemacrophagecolony-StimulatingfactorinterleukininterferonkilobasemessengerribonucleicacidnuclearfactorkBopticaldensityperipheralbloodmononuclearcellsphosphate—bufferedsaline124抗原递呈细胞碱基对互补DNA柯克萨基腺病毒受体细胞毒T淋巴细胞病毒原液树突状细胞脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核苷三

3、磷酸酶联免疫吸附试验粒巨细胞集落形成因子白细胞介素干扰素千碱基对信使RNA核因子kB光密度外周血单个核细胞磷酸缓冲盐溶液天津医科大学博士学位论文RNARNaserpmRr．PCRTCRTHTNFribonucleicacid核糖核酸ribonuclease核糖核酸酶revolutionsperminute每分钟转速reversetranscriptionpolymerase-逆转录一聚合酶链式反应chainreactionTcellreceptorT细胞抗原受体helperTlymphocyte辅助性T细胞tumornecrosisfactor肿瘤坏死因

4、子天津医科大学博士学位论文摘要第一部分：表达分泌型sT13RII胞外区．RANTES融合基因重组腺病毒的构建与鉴定目的：构建表达分泌型sTBRII胞外区．RANTES融合基因重组腺病毒并鉴定其在肿瘤细胞的表达。方法：(1)RT-PCR法扩增小鼠TBRII胞外区和RANTES基因；(2)重叠PCR法扩增sTBRII胞外区一RANTES融合基因；(3)将融合基因克隆至pDC316载体，采用AdMaxAdenovirusVectorCreation试剂盒构建表达融合基因重组腺病毒；(4)表达融合基因重组腺病毒转染小鼠肺腺癌L795细胞系，WestemBlot法

5、鉴定细胞内表达。结果：(1)经测序证实RT-PCR正确扩增了小鼠TBRII胞外区、RANTES基因；(2)经测序证实重叠PCR币确扩增了sTORll胞外区．RANTES融合基因；(3)重组质粒pDC316／融合基因经酶切鉴定正确，与pJMl7双质粒共转染获得表达融合基因重组腺病毒，病毒滴度为8×1010pfu／ml；(4)转染后的LA795细胞经Westernblot法鉴定有相应的特异性条带出现。结论：(1)成功构建表达分泌型sT8RII胞外区一RANTES融合基因重组腺病毒；(2)表达融合基因重组腺病毒可在LA795细胞内表达。关键词：TGF．B、T1

6、3RII、RANTES、融合基因、重组腺病毒第二部分：表达分泌型sT13RII胞外区-RANTES融合基因重组腺病毒抗肿瘤作用的实验研究目的：探讨表达分泌型sT1BRII胞外区．RANTES融合基因重组腺病毒抗肿瘤作用。方法：(1)重组腺病毒Ad—TBR／I胞外区、Ad—RANTES、Ad—sTGFBRⅡ胞外区一RANTES转染LA795肿瘤细胞，ELISA法检测转染后细胞培养l天津医科大学博士学位论文上清中游离TGF—Bl、RANTES的表达水平；(2)细胞记数法体外制备转染后细胞的生长曲线；(3)AnnexinVFITC法检测转染后细胞的凋亡；(4)

7、转染后细胞培养上清趋化小鼠脾细胞；(5)转染后的细胞(1x105个)接种T739小鼠，观察成瘤时间和生存时间；(6)1×1010pfu的重组腺病毒Ad—TBRII胞外区、Ad—RANTES、Ad—sTGFBRII胞外区RANTES两次局部注射荷瘤小鼠，观察肿瘤的大小变化并统计肿瘤的重量、计算抑瘤率：(7)ELISA法检测局部注射后小鼠外周血IL2、INF—r的水平；(8)annexinVFITC法检测局部注射后肿瘤细胞的凋亡。结果：(1)转染Ad～sTGF§RII—RANTES的细胞培养上清中游离TGF一8l的水平显著减低丽有高水平的RANTES；(2)

8、生长曲线显示，转染Ad—sTGFBRII胞外区-RANTES组的细胞与对照组相比