毛竹pescl6基因的克隆与其原核表达分析

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1、第一部分竹子生物学基础胞分生活动有关。竹子分子生物学研究刚刚起步，关于竹子顶端分生活动分子机理的研究尚属空白。本研究以重要经济竹种毛竹（Phyllostachysedulis）为试材，从与SAM活性密切相关的基因SCL6入手，采用RT-PCR和RACE技术，克隆SCL6同源基因的cDNA全长，利用实时定量PCR技术检测了该基因在毛竹不同组织中的表达情况，并通过原核表达来实现该基因的体外表达获得目的蛋白，为深入开展蛋白的结构与功能研究奠定基础。1材料与方法1.1材料培养室内的生长期6个月的毛竹（Phyl

2、lostachysedulis）实生苗。1.2PeSCL6基因的克隆毛竹各组织的总RNA的提取采用Trizol法（Gaoetal.,2006），cDNA和RACEcDNA的合成分别使用Promega公司的反转录试剂盒和SMARTRACE试剂盒（Clontech公司）。根据水稻（Oryzasativa）SCL6基因ORF序列设计保守区引物：PeSCL6-F：5′-ATGTCCTGCGATCTCCACCCCA-3′和PeSCL6-R：5′-GCACCGCCAGGCTGACACC-3′。以毛竹叶片cDNA为

3、模板扩增毛竹SCL6基因。PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸2min，共35个循环；72℃延伸10min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，目的片段回收并连接到pGEM-Teasy载体（Promega公司），阳性克隆送华大基因公司测序。根据保守区序列设计3′RACE引物，3-1：5′-CCGAGCCTGAAGGTGACGGCATTGG-3′；3-2：5′-CTCCCGCATCACGCCCTCAGCCTC-3′；和5′RACE引物5-1：5′-CTG

4、GGGCTGCGGTTGTAGAGGACGG-3′；5-2：5′-CCATGGATGGCCTCCTCCACCGCGGC-3′。操作步骤参考SMARTRACE试剂盒说明书。1.3生物信息学分析利用DNAStar软件对获的序列进行拼接和初步分析，分别应用ProtScale（Kyteetal.,1982）、SOMPA（Deleageetal.,1997）、MotifScan等在线软件分析编码蛋白的亲水性/疏水性、二级结构和功能域。利用Mega4.0软件采用NJ法（Neighbor-Joining，邻接法）构

5、建基于SCL6同源蛋白序列的系统进化树。1.4组织表达分析根据获得的基因序列设计实时定量PCR引物，PeSCL6-1：5′-CGGCTCAGGAACCTTCTCGC-3′；和PeSCL6-2：5′-GCTGCCACCACAGCACTAACG-3′。以毛竹Actin-7基因（高志民等，2009）为内参，利用罗氏480荧光定量PCR仪和SYBRPremixExTaqTM（TaKaRa）实时定量PCR试剂盒对毛竹根、茎、叶和鞘四个组织PeSCL6的表达情况进行分析。PCR扩增反应体系为：2×SYBRPrem

6、ixExTaq10μL，模板cDNA2μL，引物PeSCL6-1、PeSCL6-2各0.4μL（10μmol），用水补充至20μL。程序为标准两步-ΔΔCt法：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃复性34s，共45个循环。每种材料设置3次重复，2法分析实验数据（Livaketal.,2001）。1.5原核表达根据拼接序列设计编码框引物，ORF-F：5′-ATGTCCTGCGATCTCCACCCCA-3′，ORF-R：5′-GCACCGCCAGGCTGACACC-3′，以毛竹叶片cDNA为模版扩增

7、PeSCL6编码框，PCR产物连接pGEM-T载体，阳性克隆送华大测序。根据PeSCL6序列特征和原核表达载体（pET-30a）的多克隆位点特征，设计带有NdeⅠ和HindⅢ酶切位点的引物，pro-F：5′-catatgATGTCCTGCGATCTCCACCCCA-3′，pro-R：5′-aagcttGCACCGCCAGGCTGACACC-3′以测序正确的含有PeSCL6编码框的质粒为模板，扩增产物经测序正确后，经双酶切（NdeⅠ和HindⅢ）后克隆到pET-30a的多克隆位点，形成重组表达载体。-1

8、电转化法将重组载体转入表达菌株BL21（DE3）感受态细胞，卡那霉素（100mg·L）抗性平板筛选出的单克隆于菌落PCR检测后接入5mlLB培养基过夜培养，然后按1:100接种到含有卡那霉素的新-1鲜LB培养基中继续培养至OD600到达0.6-0.8，加入终浓度为400μmol·L的IPTG进行诱导培养，同时以含有pET-30a空载体的表达菌株做对照。收集菌体，用1%的SDS剧烈震荡破菌后，离心，上清进行SDS-PAGE电泳分析（5%的浓缩胶、12%的分