annexinⅰ在子宫内膜异位症中的作用及机制的研究

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1、·中文摘要·AnnexinI在子宫内膜异位症中的作用及机制研究目的子宫内膜异位症(内异症，Endomelriosis，EMS)累及10—15％的育龄妇女，且发病率呈上升趋势，虽然是良性病变，但其病理过程表现出浸润、转移等恶性病的特征。目前有关内异症发生的分子机制尚不清楚。研究表明，子宫内膜异位症(endometriosis，EMS)在位内膜基因／蛋白表达谱的改变可能是内异症发生的遗传学基础，这些改变直接影响子宫内膜异位症的发病过程，影响逆流经血中的内膜碎片的粘附、侵袭和异位生长。在前期工作中，通过比较EMS在位内膜与正常的子宫内膜蛋白质组学的变化情况，我们发现膜联蛋白家族成员Annexi

2、nI蛋白为差异表达明显的基因，提示其可能与内异症的发生相关，但其具体作用机制尚不清楚。AnnexinI是一种Ca2+依赖性的膜联蛋白，定位在细胞浆，或是以钙依赖的方式与细胞膜或者细胞骨架相连，在细胞信号转导、DNA复制、细胞分化、粘附、凋亡及钙离子通道的形成等诸多生命活动中发挥重要的作用。AnnexinI为受体酪氨酸激酶的底物，对磷脂酶A2(PLA2)具有抑制作用，进而对前列腺素的代谢具有负调控的作用。研究发现AnnexinI可以和多种蛋白质发生相互作用，如S100家族成员、F．肌动蛋白、胞浆磷脂酶A2、表皮生长因子受体(epithelialgrowthfactorreceptor,EG

3、FR)以及0【481整合素等。AnnexinI存在多个潜在的磷酸化位点，可以作为EGFR酪氨酸激酶的磷酸化底物，特异性的调节有丝分裂激活的蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinases，MAPK)信号转导通路，参与细胞的生命活动。在恶性肿瘤疾病中发现AnnexinI的表达水平出现多样化的情况，并且发现其与肿瘤细胞的分化程度有关。在妇科疾病中发现AnnexinI在子宫内膜非典型增生中高表达，在子宫内膜腺癌组织中表达减低。研究表明子宫内膜异位症具有侵袭和转移等某些恶性疾病的病理特征，其病理改变以及临床表现上都与肿瘤疾病有着相似之处。这些研究结果提示我们可以从研究肿瘤

4、细胞的生物学角度去观察子宫内膜异位症在位内膜细胞功能的变化情况，并以此为研究方向来探讨其分子病理的情况。本研究拟首先观察AnnexinI在临床EMS病人中的表达情况，同时参照文献报道的方法在体外分离和培养人子宫内膜腺上皮细胞，在这些工作的基础上采用体外实验进一步探讨AnnexinI在子宫内膜异位症中的具体作用机制。方法一、临床资料的收集及观察AnnexinI的表达情况1选择2005年6月至2006年6月，因子宫内膜异位症在中国医科大学盛京医院妇产科经开腹手术或腹腔镜手术行子宫切除术的病例组织，选择同期因宫颈病变CINIII行子宫切除的患者的子宫内膜组织为对照(对照组)2免疫组织化学方法检

5、测AnnexinI在子宫内膜异位症组织中的表达情况3免疫荧光化学方法检NAnnexinI在子宫内膜异位症组织中的表达情况。4实时定量PCR(Real．timePCR)方法检NAnnexinI在子宫内膜异位症组织中的表达情况。5westemblot方法检NAnnexinI在子宫内膜异位症组织中的表达情况。二、体外分离及培养人子宫内膜细胞1收集标本2用胶原酶消化，筛网滤过的方法分离培养人子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。3倒置光学显微镜下观察细胞的形态、贴壁状态。4利用免疫细胞化学方法鉴定培养细胞的纯度。5利用免疫荧光技术鉴定培养细胞的纯度。6利用免疫细胞化学方法检NAnnexinI的表达情况。

6、7三重免疫荧光的方法检$1JAnnexinI在子宫内膜腺上皮细胞中的分布情况。三、AnnexinI在子宫内膜异位症中的作用机制21收集临床新鲜子宫内膜标本。2用含有EGF的培养液培养正常人子宫内膜腺上皮细胞及内异症在位内膜腺上皮细胞。3倒置光学显微镜下观察细胞的形态、贴壁状态。4细胞粘附试验观察细胞在底物上的粘附能力。5westernblot方法检测EGF作用后两种内膜腺上皮细胞中细胞粘附分子ot413lintegrin和AnnexinI的表达情况。6三重免疫荧光技术检测AnnexinI与细胞粘附分子ct4131integrin在正常内膜腺上皮细胞中的共分布情况。7免疫共沉淀方法检NAn

7、nexinI与细胞粘附分子a413lintegrin在正常内膜腺上皮细胞中相互作用情况。8免疫共沉淀方法检测EGF作用后两种内膜腺上皮细胞中AnnexinI与细胞粘附分子a413lintegrin相互作用情况。9免疫沉淀方法检测EGF作用后异位症内膜腺上皮细胞中AnnexinI酪氨酸磷酸化水平。仕甲耋口7R1收集因子宫内膜异位症经开腹手术或腹腔镜手术行子宫切除术的患者35例，选择同期因宫颈病变CINIII行子宫切除的10例患者的子宫