鸡胚胎原始生殖细胞建系能力的研究

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1、秦洁：鸡胚胎原始生殖细胞建系能力的研究鸡胚胎原始生殖细胞建系能力的研究研究生：秦洁导Oiti-陈国宏教授李碧春教授中文摘要胚胎原始生殖细胞(EmbryonicPrimordialGermCells，EPGCs)是生殖母细胞的前体细胞，是精子或卵子的祖先细胞，在多能干细胞研究领域中已成为一个新的干细胞资源，亦是近年来干细胞研究的又一个热点。基于目前国内外对鸡胚胎原始生殖细胞(EPGCs)正处于起步的研究现状，本研究对这一胚胎生殖系干细胞进行了系统的探索性研究。在鸡胚发育的第14期血液中、第19期和第28期的生殖腺中采用不同的分离提取方法分别获取EPGCs，并进行体外培养，以探讨分离

2、培养EPGCs的适宜时期和方法；系统地探索了EPGCs的体外培养体系、传代方法和条件、不同冷冻体系对鸡EPGCs冷冻保存的效果以及外源性细胞因子mLIF、hSCF、bFGF和hIL．11对体外培养的鸡EPGCs增殖和分化的影响，以期筛选出鸡EPGCs合适的体外培养体系和冷冻保存条件；同时利用不同特异性化学物质定向诱导EPGCs向脂肪细胞：神经元样细胞分化，以及尝试对EPGCs单细胞进行体外培养克隆传代、检测其形态特征、表面标记及体外分化等特征特性，为建立EPGCs干细胞系以及体外研究胚胎发育、基因组学研究、药物筛选等提供有价值的参考依据。研究结果主要归纳为以下几个方面：1．采用F

3、icoll密度梯度离心法+酶解法、单独EDTA．酶解法两种方法，分别提取第14期血液(孵化53小时)、第19期(孵化72小时)和第28期(孵化132小时)生殖腺中的鸡EPGCs，比较在相同的体外培养条件下两种分离方法获取三个发育时期的鸡EPGCs数量、存活率和存活时间的差异。结果表明：单独EDTA．酶解法2扬州大学博士学位论文分离到的细胞总数(2．7x104／胚胎)极显著地(P

4、种分离方法之间差异不显著(P>0．05)；将三个不同胚胎发育时期所提取的EPGCs在不加任何生长因子的培养基中进行培养，结果显示：第14期提取的EPGCs培养存活时问最短，在60～72h之间；第19期的最长，在80～88h之间；第28期的介于两者之间，存活时间为72～80h。三个时期所提取的EPGCs存活率差异显著(P<0．05)：在第19期和第28期生殖腺中提取的EPGCs存活率明显高于第14期(P<0．01)，但在第19期和第28期之间EPGCs存活率和存活时间差异不显著(P>0．05)。实验结果表明，采用单独酶解离法在鸡胚发育的第19期或第28期提取生殖腺中聚集的EPGCs

5、较为适宜，具有较强的可操作性，可满足体外操作的要求。2．将采用单独酶解离法分离得到的第19期和第28期鸡EPGCs接种到四种不同的培养体系中，比较在不同的培养体系中各种因素对EPGCs培养传代的影响。实验结果表明：在无饲养层，培养液中不添加外源性细胞因子的培养体系1中，无EPGCs的AKP阳性克隆形成；在无饲养层，培养液中添加细胞因子培养体系2中，培养72h后有一代EPGCs的AKP阳性克隆形成，克隆形成率为33．33％，但EPGCs在传代后不能重新聚集形成集落；在以鸡胚胎成纤维细胞为饲养层，培养液中不添加外源性细胞因子的培养体系3中，培养48h后可见细胞成集落状隆起生长，但传至

6、三代后未观察到EPGCs集落形成，第一代和二代EPGCsAKP阳性克隆形成率分别为40％和120％。与其它三个培养体系相比，将EPGCs接种鸡胚胎成纤维细胞饲养层，培养液中添加10％的胎牛血清、2％的鸡血清、2mmol／LL一谷氨酰胺、lmmol／L丙酮酸钠、5．5x10-5mol／LB．巯基乙醇、10I_tl／ml非必需氨基酸、10IU／ml鼠白血病抑制因子(Mouseleukemiainhibitoryfactor，mLIF)、5ng／m1人干细胞生长因子(Humanstemcellfactor，hSCF)、10ng／ml碱性成纤维生长因子(Fibroblastgrowthf

7、actor-basic，bFGF)、0．04ng／n=11人白细胞介素．11(Humaninterleuldn．11，11IL．11)，10ng／ml胰岛素样生长因子(Humaninsulin—likegrowth秦洁：鸡胚胎原始生殖细胞建系能力的研究factor，hlGF)的高糖DMEM培养体系4中培养，培养约2~3d时开始出现鸟巢状的EPGCs集落，以多次离散法进行传代获得了五代EPGCs的AKP阳性克隆，1^5代EPGCs克隆形成率分别为80％、66．67％、46．67％、