鸡胚胎干细胞诱导为雄性生殖细胞及转基因鸡的制备

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1、国家科技计划项目(30871791)NationalScienceandTechnologyPlanningProject(No．30871791)2010年江苏省普通高校研究生科研创新计划项目ScientificInnovationResearchofCollegeGraduateinJiangSuProvincein2010孙敏鸡胚胎于细胞诱导为雄性生殖细胞及转基因鸡的制备鸡胚胎干细胞诱导为雄性生殖细胞及转基因鸡的制备冀銎姜教授IY2IIIIIIIIIIIl2IIIIIl5IIIIIl8LIIIl3IILIIoIIIIIY攀导师：李碧春教授ZZ5bJUb专业：动物发育与遗

2、传工程(扬州大学动物科学与技术学院，扬州225009)摘要生殖干细胞在有性繁殖的生物中肩负着将遗传信息在世代中传递的重要任务，即通过精卵结合产生新的个体。生殖细胞的种系传递特性使得它成为动物胚胎学、发育生物学和细胞生物学等学科关注的研究对象之一。生殖细胞的可塑性使其能代替胚胎干细胞(Embryonicstemcell，ESC)用于治疗和遗传修饰，而不涉及伦理和免疫排斥问题，故引起生物学界极大关注。因此，如何迅速开展诱导来源于其他组织的干细胞分化成为雄性生殖细胞的研究显得很有必要和迫切。目前将ES细胞诱导为生殖细胞的研究已经开展，但诱导方法较多，效率较低。相对于人、鼠的ES细胞

3、，使用鸡胚ES细胞可以克服伦理方面的限制，且取材方便，模拟临床治疗实验具有十分明显优势。因此本研究以家鸡做为实验动物模型，在比较ES和SSCs异同点的基础上，筛选适宜视黄酸(RA)浓度，比较不同基质蛋白、支持细胞、不同时期睾丸提取液和睾丸细胞条件培养液诱导ES向雄性生殖细胞方向分化的效果，为建立适宜的诱导体系和后来的临床研究提供参考。同时将诱变后有抗病毒活性的MMx蛋白通过SSCs体内介导法制备抗病转基因鸡，为制备转基因动物和培育新品种提供新的途径和思路。研究结果如下：(1)采用免疫荧光和碱性磷酸酶联合检测法鉴定鸡Es细胞和SSCs细胞的干细胞特性，RT-PCR方法检测两种细

4、胞在Cvh、C．kit、DAZL、GDF3、integrinQ6、integrinB1、Nanog、Oct．4、Sox2、Stra8基因表达上的异同性，并通过免疫细胞化学和Westernblot检测TRA-1-60、TRA．1．81、C—kit、DAZL、integrina6、integrinB1、Sox2蛋白在两细胞上的表达差异情况。结果表明：ESC和SSCs基因表达存在差异，即未分化的ES细胞表达GDF3、Nanog、Sox2基因；SSCs表达C-kit、integrina6、integrin61、Cvh、Stra8、Dazl基因，两种细胞mRNA均检测到Oct一4、13

5、-actin基因的表达。蛋白水平上，免疫细胞化学方法和westernblot方法检测的5个蛋白中ES细胞表达Sox2蛋白，SSCs表达C．kit、integrina6、integrinl31、Dazl蛋白。这两细胞的特异性标记物，可为ES与SSCs细胞的鉴定提供依据。扬州大学博i二学位论文(2)在鉴定鸡胚ES细胞性别的基础上，将雄性ES细胞接种到24孔板中，分别采用10一mol／L、10’4mol／L、10～mol／L、10曲mol／LRA浓度进行诱导，通过细胞形态变化和上章获得的差异基因表达量变化，筛选适宜RA诱导浓度，同时探讨RA促进鸡ES向生殖细胞方向分化的潜能。结果显

6、示：根据半定量PCR和诱导过程中细胞形态观察，确定了RA的适宜诱导浓度为10～mol／L。在适宜浓度诱导过程中，诱导4天时类胚体出现，随后类胚体逐渐增大，8d时类胚体开始解体，随后变为单个小的圆形细胞，但10天时未观察到生殖细胞样细胞。诱导过程中相应基因表达量也发生变化：Es细胞特异基因Nanog、Sox2表达量下降，生殖细胞特异基因Stra8、Dazl、integrina6、integrinp1、C-kit表达量上升。特别是Stra8基因，与自分化相比，显著升高。结果证明RA可启动生殖细胞相应基因的表达，对鸡胚ES细胞向雄性生殖细胞方向分化具有积极作用。(3)ES细胞在体内

7、特定小生境中发育，其内各种基质蛋白与其他细胞相互作用影响ES细胞的增殖分化。本实验将ES细胞分别接种于胶原蛋白(collagen)、纤维连接蛋白(fibronectin)和层粘连蛋白(1aminin)包被的培养皿中，在适宜RA浓度作用下研究Es细胞向生殖细胞方向发育的可能性。结果显示：三组诱导实验中，细胞水平上RA+fibronectin诱导4天时最早观察到类胚体的出现，随后细胞体积增大，在10天时观察到精原样细胞。层粘连蛋白和胶原蛋白组在诱导6天时观察到类胚体形态，而层粘连蛋白组在10天时观察到SSC