逆转录病毒为载体制备转基因鸡的初步研究

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1、万方数据UniversityCode：10225RegisterCode：09044DissertationfortheDegreeofMasterStudiesontheProductionofTransgenicChickenviaRetrovimsVectorsCandidate：Supervisor：AcademicDegreeAppliedfor：Speciality：DateofOralExamination：University：ZhangQiu—tingPro￡AnTie—zhuMasterDevelopmentalBiolo

2、gyJune，2009NortheastForestry万方数据摘要为了建立更加完善的逆转录病毒法生产转基因鸡的技术体系。本研究选用增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)为外源基因(亦为报告基因)、pEASY-T3为克隆载体、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)为骨架的puro—pBabe质粒为表达载体、含有疱疹性口腔炎病毒G蛋白基因的pVSV-G质粒为包装载体、23910A1细胞为包装细胞。在PCR扩增出EGFP基因序列的基础上，分别构建克隆载体pEASY-T3．EGFP和重组表达载体puro—pBabe．EGFP。采用磷酸钙转染法与竞争包装法相结

3、合的方法将puro—pBabe—EGFP与包装载体pVSV-G共同转入23910A1细胞中以产生逆转录病毒。病毒原液经滴度检测后，采用低温超速离心的方法浓缩200倍。浓缩病毒液以注射的方式导入鸡胚的囊胚下腔进行原始生殖细胞(PGCs)的鸡胚内转染，然后将鸡胚置于孵化箱中进行孵化。待孵化5．5d时，随机选取试验鸡胚，提取其全胚基因组DNA进行检测。其结果为：1)克隆载体的PCR鉴定结果以及测序结果与理论序列的比对结果表明，已成功构建出与预期设计完全一致的克隆载体pEASY-T3一EGFP；2)表达载体的PCR鉴定结果、测序结果与理论序列的比对结

4、果以及表达载体瞬转入胎牛中肾成纤维细胞中的表达结果表明，已成功构建出与预期设计完全一致并且具有体外表达EGFP活性的重组表达载体puro．pBabe—EGFP；3)由病毒原液的滴度测定数据计算出试验得到的逆转录病毒滴度为2．3x10’／ml，结果表明采用磷酸钙转染法与竞争包装法相结合的方法包装出高滴度的逆转录病毒；4)PCR检测鸡胚基因组DNA整合EGFP基因的结果为，有75％的鸡胚呈阳性；在PCR检测基础上进行Southem杂交检测，结果有66．7％的鸡胚呈阳性。表明包装逆转录病毒已经将EGFP基因整合到基因组中，同时也证明了以MoMLV为

5、骨架的转录病毒载体可感染不同物种来源的细胞。综上所述，本研究结果不仅为采用逆转录病毒感染法制各转基因鸡提供了可行性依据，同时也为进一步证明逆转录病毒感染法是一种可应用于多种动物的高效转基因工具提供了依据。此外，本研究结果为深入开展转基因鸡与以鸡蛋为生物反应器相关的转基因家禽的研究奠定了基础。关键词逆转录病毒；增强型绿色荧光蛋白；载体构建；转基因鸡：万方数据AbstractInordertoestablishthetechniquesystemofproducingtransgenicchickenmediatedbyretrovirusmor

6、eperfectTheEGFPgenewasusedforreportgeneandforeigngene．TheclonevectorandthepackagingvectorwerepEASY-T3andplasmidcontainedvesicularstomafitisvirusGglycoproteingenerespectively．Theexpressionvectorpuro—pBabewasbasedontheMoloneymurineleukemiavirus(MoMLV)．Andthepackagingcellswere

7、23910A1cellsinthisresearch．AftercloningEGFPgene，therecombinationplasmidpEASY-T3一EGFPandrecombinantexpressionvectorwereestablished．Thepuro—pBabe—EGFPvectorandpackagingvectorweretransfectedinto293IOAlcellstogetherbymeansofcalciumphosphatetransfectioncombinedwithcompetitionpac

8、kingtoproductretrovirus．Afteranalysingthetitreofretrovirusoriginalliquid，retroviru