鸡卵黄抗体的制备以及金磁微粒为载体去除人血浆部分

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1、鸡卵黄抗体的制备以及金磁微粒为载体去除人血浆部分【摘要】目的:以人血浆白蛋白（HSA）和IgG为免疫原,制备特异性鸡卵黄抗体IgY(Eggyolkimmunoglobulin）,并将其固定于金磁微粒表面,用于HSA和IgG的去除研究。方法:用HSA、IgG以及混合成分分别作免疫原免疫Roman母鸡。制备抗HSA和IgG鸡卵黄抗体IgY,并对IgY的分离提取条件进行优化。SDSPAGE和间接ELISA检测IgY的纯度和效价。将高效价IgY固定于金磁颗粒表面进行血浆高丰度蛋白去除研究。结果:免疫后60～120d内,

2、鸡血清抗体效价可达1∶15000～1∶25000;收获鸡蛋,提取得到的卵黄抗体IgY效价可达1∶10000～1∶25000,纯度98%以上;采用金磁微粒载体固定IgY,可对血浆中的HSA,IgG进行特异性的去除。结论:人血浆中的高丰度蛋白成分HSA和IgG免疫产蛋母鸡后,可从鸡卵黄中分离提取到高效价、高纯度的卵黄抗体IgY;IgY偶联于金磁微粒表面可特异性的去除人血浆中的HSA和IgG,作为血浆蛋白质组学研究的一种新方法,有较好的应用前景。【关键词】人血浆白蛋白人血浆IgG卵黄抗体金磁微粒去除　　人血浆含有上万种

3、蛋白成分,是最复杂的蛋白质组学研究对象。血浆蛋白质丰度差异大于1010,白蛋白（HSA）、IgG等10种高丰度蛋白占到了血浆总蛋白的90%［1,2］。高丰度蛋白的存在,影响血浆中一些低丰度蛋白(μg/L或ng/L)的检出,而这些被遮盖的低丰度蛋白很可能是信号传导和调控的关键蛋白或某些重大疾病的关键指示分子,对疾病的早期诊断和疗效检测具有重要意义［3］。因此建立特异地去除血浆高丰度蛋白的方法,提高血浆中低丰富蛋白检测的灵敏度意义重大。目前,抗体亲和法以其对靶蛋白高度的特异性和可重复使用性成为血浆蛋白去除研究最为有效

4、的方法［4,5］。我们利用鸡卵黄抗体(IgY)产量大、特异性强、获取方便、成本低等优点［6-8］,制备特异性抗HSA和IgG的鸡卵黄多克隆抗体,并对其分离提取条件进行优化,得到大量较高纯度和活性的IgY。将IgY偶联于金磁微粒表面,研究其在HSA和IgG去除方面的应用。　　1材料和方法　　1.1材料人全血浆购自西安市血站,弗氏完全/不完全佐剂、bradford试剂、人血浆白蛋白均购自Sigma公司,人血浆IgG及鸡IgY标品购自北京鼎国公司,HRP标记兔抗鸡IgG购自北京博奥森公司,硫酸铵（分析纯,西安化学试剂厂

5、）等。GoldMag金磁微粒(10g/L)购自陕西北美基因股份有限公司,洗涤液(1×PBST,pH7.4),样品稀释液(1×PBS,pH7.4)。健康Roman母鸡,未进行过防病免疫,饲养期间保证鸡舍及水食清洁。　　1.2方法　　1.2.1免疫原的制备参照Schade等［9］的建议剂量,控制免疫原剂量在0.1～1.0mg之间,制备3种不同成分的免疫原,Ⅰ:人血浆白蛋白;Ⅱ:人血浆IgG;Ⅲ:人血浆白蛋白与IgG混合免疫原（质量比为1∶1）。3种类型的免疫原均用生理盐水稀释到合适的浓度,加等量的弗氏佐剂,于涡旋振荡

6、器上充分乳化。　　1.2.2动物免疫健康Roman母鸡于100～110日龄开始免疫,皮下多点注射,注射量0.5mL左右,每种免疫原注射2～3只鸡。首次免疫用弗氏完全佐剂,1个月后改用弗氏不完全佐剂相同剂量加强免疫,以后每隔15d用弗氏不完全佐剂加强免疫1次,直至达到稳定效价。后视效价变化选择加强免疫时间。第3次免疫后收取鸡蛋,4℃保存。　　1.2.3效价检测于每次免疫后7～15d以间接ELISA检测鸡血清中的抗体效价［10］,酶标二抗的工作浓度为（1∶2000）。免疫原适当稀释后,100ng/孔包被96孔板于4℃

7、过夜(pH9.6),取出96孔板,洗涤液洗涤3次,加入不同稀释度的鸡血清100μL/孔,37℃温育2h,洗涤液洗涤3次,加入稀释后的HRP标记兔抗鸡IgG100μL/孔,37℃温育2h,洗涤液洗涤3次,加入底物四甲基联苯胺,室温反应10min,2mol/LH2SO4终止反应。酶标仪检测450nm的A值。以阳性血清A450值大于阴性对照平均值2.1倍时的血清最低稀释度为ELISA效价（若阴性对照的A450低于0.05,则以0.05计算）。　　1.2.4IgY的制备①采用水溶解法得到卵黄抗体水溶液,优化溶解条件。具体

8、操作为:鸡蛋去除蛋白和卵黄膜得卵黄液,用超纯水稀释搅拌离心,上清即卵黄抗体水溶液用饱和硫酸铵梯度沉淀、透析得IgY粗品,Bradford法测定IgY粗品含量。设计L9(34)正交实验,对影响IgY水溶解的因素:溶解体积、搅拌时间、离心时间、离心速度,进行优化。②卵黄抗体水溶液,用饱和硫酸铵选择合适的终浓度沉淀2次,4℃透析24h。通过SDSPAGE检测提取纯度。③将硫酸