鸡胚原始生殖细胞增殖调控机制的研究

《鸡胚原始生殖细胞增殖调控机制的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、糠江太擘霭±擘链、电熏鸡眭壤始生毽细貔增殖谭整枫釉的研究摘要家禽常被用作发育生物学研究的动物模型。很多研究致力在更深层次揭示家禽发育的机理，尤其是生殖系统的发育，在内源性调节的基础上力图通过外源性调控，以提高家禽的繁殖性能。本实验以艾维因鸡胚为材料，分离了胚胎期原始生殖细胞(PG-C)。并进行了原代和传代培养及其分化潜能的检测，探讨了多种体细胞对P}(泥体外增殖的影响，研究了植物性生物活性物质大豆黄酮(DAD和槲皮素(QUE)对POC增殖的作用及其胞内信号传导机制。1．鸡胚原始生殖细胞原代和传代培养模型的建立在体视显微镜下用玻璃针分

2、离3．5√Id鸡胚生殖嵴，用胰蛋白酶+EDlA消化分散组织，以含5％胎牛血清(FCS)的M199培养液进行PGC和体细胞的共培养，从而建立其原代培养模型，然后将PGC传代到饲养层上进行传代培养。结果表明5％FCS在POC与体细胞原代培养中有较好的促增殖作用，而在传代培养时，添加了5％FCS的培养液和无血清ITS培养液(10pg／mi胰岛素、5坞，mI转铁蛋白和3x104moFL亚硒酸钠的培养液)能较好地维持并促进P‘3C的存活和细胞集落数的增加(P∞．05)；碱性磷酸酶(AKP)和过碘酸雪夫氏反应(PAs汲c-Mr和SSEA．1免疫

3、细胞化学染色均证实所分离的细胞为P(把：传代的PGC在饲养层上培养60h后增殖细胞核抗原(PCNA)染色呈强阳性。提示培养的PGC具有较强的增殖活性。体外分化实验表明PGC在去除饲养层和生长因子的情况下能分化成多种细胞，根据其形态可分为神经样细胞、上皮样细胞和骨骼肌样细胞。经神经元特异性烯醇化酶(NsE)和角蛋白免疫细胞化学鉴定，证实了神经元样和上皮样细胞的免疫学特征，表明培养的POC具有分化的多能性。上述结果表明经PGC．体细胞原代共培养后再传代于饲养层上进行传代培养的模型可以用作PGC增殖活性和分化潜能的研究．2．体细胞对鸡胚原

4、始生殖细胞增殖的调控作用为了探讨鸡胚POC生长的理想支持体系，实验采用三种来源于鸡不同的体细胞(成纤维细胞、骨骼肌细胞和鸡小黄卵泡颗粒细胞)制备饲养层。比较三种体细胞对PGC生长和增殖的影响。周肘在三种体细胞饲养层上添加FCS、生长因子及白血病抑制因子(UF)，比较不同生长因子或细胞因子对PGC生长和增殖的影响。另外，用溴脱氧尿苷(BrdU)掺入显示细胞的增殖活性。部分POC作传代培养，并添加FCS、LIF和人参皂甙(GS)以研究其对PGC传代增殖的影响．结果表明成纤维细胞饲养层和卵泡颗粒细胞饲养层对鸡胚P(圮的存活和增殖效果较骨骼

5、肌饲养层好，PGC数目明显多于后者(P如．05)．且BrdU标记染色表明成纤维细胞要优于颗粒细胞：生长因子和细胞因子的比较发现，在三种饲养层上，0．5％FCS+LIF(10ng／m1)组效果最好，其次是ITS组和FCS组．而单独添加LIF组的效果较差，尤其在颗粒细胞上表现更明显(p∞．05)．传代培养发现，铷d后PGC大量增殖，特别是添加了GS(IOpg／m1)后形成更大的细胞团，效果更为明显。结果提示：鸡胚POC在鸡胚成纤维饲养层上培养效果较好，是鸡胚PGC较理想的支持体系；且添加低浓度血清和浙江大学博士学位论文码!癌：荣殆生翅．

6、鲴r廖埔稽调整扰韵叻瑷疗LIF及抗氧化性营养素GS对PGC的增殖有明显的促进作用．3．聋白激酶A和c系统对鸡胚PGC增殖的调控机蠲利用PGC培养模型探讨了蛋白激酶A(PKA)和c(PKc)信号系统在PGC增殖中的作用．传代培养时，培养液中分别添加腺苷酸环化酶激活剂福司克林(FRSK)和佛波酯(PMA)以分别活化PICA和PKC，并与相应的抑制剂H"和}b联合处理t'Cd2；用BrdU标记细胞的增殖情况。实验结果表明FRSK(10—1—10。M)刺激鸡胚PC_d2的增殖(P<0．05)．这种效应可被H"(10。M)所抑制(P

7、)；PMA(10"SM)t㈣促进PGC的增殖。其促增殖作用可被H'(10～一lo-'M)所抑制(P(0．05)。BrdU免疫细胞化学法检测表明FRSK及PMA处理后细胞BrdU标记指数明显增高，说明PGC具有较强的增殖活性。从而证明了PKA和PKC信号通路在鸡胚PGC的增殖过程中起着重要的调控作用．4．类黄酮对鸡胚PGC增殖的调控及其机制豹研究利用PGC传代培养模型研究两种类黄酮DAI和QUE对鸡胚PC,-C增殖的影响，并探讨了其作用机制。结果表明，DAI(IPg／m1)和QUE(0．01-11Jg／m1)显著促进IW_,C的增殖(

8、P