cd133阳性造血祖细胞对结直肠癌细胞生物学特性的影响

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1、硕士学位论文CD133阳性造血祖细胞对结直肠癌细胞生物学特性的影响硕士研究生：熊汉真指导教师：李学农摘要研究背景和目的结直肠癌(colorectalcarcinoma,CRC)是我国常见的消化系统恶性肿瘤之一，而转移是患者的主要致死原因。肿瘤转移是一个多步骤、多阶段的复杂过程，转移的肿瘤细胞经历了细胞骨架变化、黏附特性的改变、运动能力的增强及蛋白水解酶表达增加等一系列改变。动物实验最新的研究表明，造血祖细胞与肿瘤转移有着密切联系，KaplanRN等利用B半乳糖苷酶标记骨髓细胞移植的小鼠Lewis肺癌模型、小鼠B16黑色素瘤模型和c-myc转基因小鼠自发性淋

2、巴瘤模型发现：VEGFR-1阳性造血祖细胞(vascularendothelialgrowthfactorreceptor-1hemopoieticprogenitorcells，VEGFR-I+HPC)首先在特定器官形成VEGFR-I+HPC细胞簇(VEGFR-I+HPCcellularclusters)，为瘤细胞准备了易于形成转移的微环境，这些细胞簇形成部位与肿瘤转移常见部位一致。研究表明，VEGFR-I+m'C充当了肿瘤转移必不可少的细胞书签(cellularbookmarking)或者说特使细胞(envoycells)。VEGFR-I+HPC并非以

3、前发现的血管内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，EPC)即VEGFR-2阳性造血祖细胞，腹腔注射VEGFR-2抗体，不能阻断VEGFR．11口C细胞簇形成及瘤转移灶形成，只能限制肿瘤转移灶生长。同时利用VEGFR-1抗体阻断或剔除VEGFR-I+HPC，则能够抑制预迁移器官造血祖细胞簇的形成与肿瘤转移。但造血祖细胞在人体肿瘤的主要作用及机制仍不十分清楚，且目前尚未在人类中文摘要肿瘤模型上得到证实，由于脐血来源广泛，获取较容易，成为骨髓及外周造血干祖细胞的极佳替代来源，我们选定CDl33+造血祖细胞，在减少其诱导分化的同时，观察

4、其对低转移人大肠癌细胞体内外的增殖和侵袭作用。CDl33是一个目前公认的造血祖细胞表面抗原，在正常及异常造血和非造血组织中均有表达，随着细胞的分化成熟其表达减弱、消失。在正常造血组织中，如人胚胎、肝脏和骨髓、脐血、成人骨髓和外周血CD34+细胞中都可检测到CDl33mRNA，而在其他成熟血细胞均未检测到其表达。同时随着最新的研究表明，CDl33mRNA在外周血中的表达里，实体恶性肿瘤转移患者的表达水平明显高于非转移患者，且以骨转移患者的CDl33mRNA表达为著。但这一结果的作用机制主要是由于CDl33+造血祖细胞或者是CDl33+肿瘤干细胞的结果尚不清楚

5、。本研究重点探讨CDl33+造血祖细胞对结直肠癌增殖、侵袭及转移的影响，阐明CDl33+造血祖细胞在结直肠癌转移中的主要生物学功能，为揭示结直肠癌转移机制及抗转移治疗奠定基础。方法1．CDl33+造血祖细胞的筛选、鉴定及培养由南方医院妇产科提供新鲜脐血标本20例，在脐血采集后6h内，利用CDl33+免疫磁珠，分离出CDl33+造血祖细胞，并分别予流式细胞仪及免疫细胞染色分析和鉴定样本量中CDl33+细胞含量，同时在减少诱导CDl33+分化的同时，培养CDl33+造血祖细胞。2．CDl33+造血祖细胞对结直肠癌细胞生物学特性的影响将CDl33+造血祖细胞与S

6、W480共趋化培养，用MTT法检测肿瘤细胞的增殖及黏附能力的影响，用Transwell小室法检测肿瘤细胞的迁移能力的变化，用Westernblot了解VEGFR-1、MMP．2、E．Cadherin的表达情况。观察CDl33+造血祖细胞作用前后细胞增殖、体外侵袭变化。3．应用整体可视化结肠癌转移动物模型观察共移植效应硕士学位论文利用稳定表达绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)的结肠癌细胞株SW480／EGFP+；通过结肠癌尾静脉注射的方法建立结肠癌转移模型，利用肿瘤细胞表达EGFP的特点，将CDl33+细

7、胞与SW480／EGFP+共培养通过尾静脉注射的方法观察肿瘤细胞成瘤能力及体内转移能力的变化，应用组织病理学及分子生物学技术对结肠癌转移动物模型进行评价和鉴定。结果1、CDl33+造血祖细胞的筛选、鉴定及培养1一由南方医院妇产科提供，脐血标本共20份(其中18份成功提取新鲜细胞，2份失败)，50"-'80ml／份，枸橼酸抗凝，经产妇和家属同意取自足月健康顺产新生儿，新鲜脐血采集后6h内，分离W,CDl33+造血祖细胞。从新鲜的脐血中得到的单个核细胞数平均为(1．48士0．19)X107／ml，经CDl33磁珠分离系统分离得CDl33+富集细胞的平均数为(1

8、．33i-0．01)xlOS／ml，新鲜脐血单个核细胞中的CDl3