na+-k+-atp酶特异表达对结直肠癌细胞生物学特性的影响及机制研究

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1、重庆医科大学博士学位论文Na+--K+--ATP酶特异表达对结直肠癌细胞生物学特性的影响及机制研究姓名：张贵海申请学位级别：博士专业：肿瘤学指导教师：李少林201205重庆医科大学博士研究生学位论文Na+．K+．ATP酶特异表达对结直肠癌细胞生物学特性的影响及机制研究★摘要结直肠癌(Colorectlcancer,CRC)是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率居世界第三位，死亡率却占第二位，远处转移是导致患者死亡的主要原因。肿瘤的转移是多因素及多步骤调控的级联过程，而侵袭穿过基底膜仅是转移过程的第一步。近

2、年来，结直肠癌经标准化疗和分子靶向治疗，其生存率虽有显著提高，但对转移性结直肠癌的治疗效果仍然有限。目前，结直肠癌的复发、转移及治疗抵抗都归因于肿瘤干细胞的存在。因此，如何抑制肿瘤转移、逆转多药耐药及特异清除肿瘤干细胞对提高结直肠癌的治疗效果极为重要。Na+-K+．ATP酶是广泛存在于上皮细胞膜上的一种跨膜蛋白，其仅亚单位在多种肿瘤组织和细胞中特异表达，包括结直肠癌，异常表达的倪亚单位涉及某些肿瘤如非小细胞肺癌、胶质瘤细胞的生长、迁移及侵袭，而13。亚单位在多数组织均有表达，作为细胞黏附分子，参与细

3、胞问紧密连接形成、维持上皮细胞原有极性，与癌上皮组织分化程度、肿瘤细胞的侵袭及转移有关。Na+一K+-ATP酶活性异常及亚单位特异表达伴随结直肠癌肿瘤的发生，但是否参与结直肠癌的转移、多药★本课题受国家自然科学基金资助(NO：30970843)4重庆医科大学博士研究生学位论文耐药及肿瘤干细胞的“干性”维持等尚不明确。因此，我们推测：Na+．K+．ATP酶亚单位在结直肠癌亲本细胞、耐药细胞及干细胞中特异表达，其中亚单位可能与肿瘤细胞的增殖、侵袭、多药耐药及干细胞“干性”维持有关。本课题拟以不同临床分期

4、的结直肠癌亲本细胞SW480、SW620、耐药细胞及肿瘤干细胞为研究对象，检测Na+-K+．ATP酶亚单位在上述3种细胞中的特异表达水平，观察特异表达的亚单位与结直肠癌细胞增殖、侵袭、多药耐药(Multidrugresistance，MOP．)、肿瘤干细胞自我更新及致瘤能力的关系，阐明Na十．K+-ATP酶亚单位特异表达对结直肠癌亲本细胞、耐药细胞及肿瘤干细胞生物学特性影响的分子机制，最终为结直肠癌的治疗提供新的靶点和思路。目的明确Na+．K+．ATP酶活性及其亚单位特异表达与人结直肠癌细胞增殖、侵

5、袭、多药耐药、干细胞自我更新及致瘤能力的关系，探讨Na+．K+．ATP酶亚单位特异表达对结直肠癌细胞生物学特性影响的分子机制，旨为有效抑制结直肠癌转移、逆转多药耐药及靶向结直肠癌干细胞(Cancerstemcells，CSCs)治疗提供新靶点。方法1．以不同临床分期的结直肠癌亲本细胞SW480、SW620为实验材料，通过递加培养液中奥沙利铂浓度建立慢性抵抗奥沙利铂细胞株SW480／o嫁，流式细胞术分选CSCs。采用MTS或MTT法检测细胞增殖能力，TransweU小室检测细胞侵袭力，用酶学比色法测定

6、Na+．K+．ATP气重庆医科大学博士研究生学位论文酶活性，荧光定量PCR及Westernblotting或流式细胞技术等检测细胞Na+．K+-ATP酶亚单位(0【1、O【2、a3及岱1)、P一糖蛋白及EpCAM／CD44表达。从Na+．K+．ATP酶亚单位中分别筛选出与结直肠癌亲本细胞、SW480／OxR及CSCs增殖、侵袭、多药耐药、自我更新及致瘤能力的有关的亚单位为治疗靶点。2．观察Na+．K+-ATP酶抑制剂Ouabain对结直肠癌亲本细胞、SW480／OxR及CSCs增殖、侵袭、多药耐药、

7、自我更新、致瘤能力及Na+-K+-ATP酶亚单位表达的影响，验证拟筛选靶点的特异性，及揭示Ouabain治疗结直肠癌的可能机制。3．构建针对Na+一K+．ATP酶亚单位的慢病毒载体并感染结直肠癌CSCs，观察携带Na+．K+-ATP酶亚单位．shRNA慢病毒载体对结直肠癌CSCs生物学特性、结直肠癌标志物EpCAM／CD44表达及凋亡等影响，进一步验证拟筛选靶点的特异性，寻求结直肠癌治疗的新靶点及可能机制。4．观察携带靶向结直肠癌CSCs的Na+．K+-ATP酶亚单位．shRNA的慢病毒载体对NOD

8、／SCID小鼠致瘤能力的影响，及其对移植瘤细胞增殖及凋亡的生物学效应，揭示靶向结直肠CSCs治疗的分子机制。结果1．SW620细胞增殖及侵袭力均较SW480细胞明显增加(P均