核因子κb炎症信号通路在全身炎症反应时肺泡巨噬细胞过度活化中的作用与emodin调节作用的实验研究

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1、核因子一KB炎症信号通路在全身炎症反应时肺泡巨噬细胞过度活化中的作用及Emodin调节作用的实验研究博士研究生：李海龙籀导教师：鼹海龙教授专业名称：申西医结合临床摘要圈的：探讨棱因子一埔炎瘫信号通路在全巍炎癜反应时肺泡臣噬细腮过度活化中的作用，观察NF．1d3p65／p50的活性和核易位情况、蛋臼激酶IKK的活性变化、炎性细胞园子的表达承平，并深入探究蛋自激酶IKK0【＆v对上述炎瘫信号通路中多个环节的协间调节效应及Emodin治疗作南的分子生物学机制；间时，迸一步搦示一氯化氮(N0)在急往重症胰腺炎惫性肺损伤大鼠发病中的双重功能及该作用与肺泡

2、巨噬细胞NF。KB活性变纯的鬻切联系，力i涤床治疗急佼肺损伤等多辞全身炎癍反应性痰病、寻求更为合适的药物作用靶点提供新的实验佐证。方法：实验一：以小鼠RAW264．7巨噬细胞系为研究对象，威用逆转录PCR、蛋崮杂交印迹、免疫细魏化学染色、兔疫荧光染色等方法，殛察emodin对由LPS诱导产生的炎症反应的调节作用。共分为7组，每缝5个培养Jilt：Groupl：RAW2{

3、54．7氍蕊纲聪正常培养组；Group2、3、4：给予LpS(10f．tg／m1)蒯激，分三个时间点30min、2hr、5hr；Group5、6；分为三个时闷点，在给予t予S<

4、101．tg／m1)裁激的基础上，同时加入emodin(20}tg／m1)进行干预，于不同作用时间点收集的样本。实验二：由NF-rJ3介导的过度炎症反威在诲多炎性痰瘸购发垒发展过程中发挥着举怒轻蓬的作用，是全搿炎症反应时复杂瘸理交纯的中，基环节，翮时也是多种潮素、多层面、多环节协丽作用的结采。为进一步阉鞠上述协丽作用的分子燕耪学税剩，应用RNA干扰技术将l姻蛋寤激酶毡及丫基因沉默，然藩观察RAW264，7小鼠臣噬纲服经LPS刺激后，NF一1cB的活化以及多种NF．rd3依赖性的下游炎性因子的表达情况。本实验共分为12组，每组5个培养皿：Grou

5、pNo：RAW264．7巨噬细胞正常培养组；GroupNl，N2：给予LPS(10pg／m1)刺激，作用30min、2hr；GroupAo：细胞与转染试剂／IKKasiRNA混和物作用48小时；GroupA1，A2：细胞经转染及IKKa干扰处理后，给予LPS(10pg／m1)刺激分别作用30min、2hr；GroupB0：细胞与转染试剂／IKK7siRNA混和物作用48小时；GroupBl，B2：细胞经转染及IKK7干扰处理后，给予LPS(101ag／m1)刺激分别作用30min、211r；GroupCo：细胞与转染试剂／IKKll&IKK7s

6、iRNA混和物作用48小时；GroupCl，C2：细胞经转染及IKK旺&IKK7同时干扰处理后，给予LPS(10lag／m1)刺激分别作用30min、2hr；于不同作用时间点收集的样本。实验三：经胰管逆行注入去氧胆酸钠复制大鼠急性重症胰腺炎急性肺损伤模型。采用凝胶电泳迁移率实验(EMSA)检测肺泡巨噬细胞中NF—kB活性和EMSA特异性，同时应用逆转录．聚合酶链反应(RT-PCR)检测肺泡巨噬细胞中的iNOSmRNA的表达，及NO、TNFo【、iNOS的水平和肺组织病理学的改变。随机分为：假手术组、模型组、硝普钠组、左旋精氨酸组、氨基胍组，每组

7、6只。分离纯化的肺泡巨噬细胞以5x105的细胞浓度，接种于24孔培养板。加入LPS和各种药物，分为对照组、刺激组(LPS10Hg／m1)、硝普钠组(LPS+硝普钠，2mmol／L)、左旋精氨酸组(LPS+左旋精氨酸，2mmol／L)、氨基胍组(LPS+氨基胍，2mmol／L)，于作用后3小时、5小时、6小时和24小时分别检测NF—kB活性、iNOSmRNA含量、TNF0t浓度和NO含量。结果：应用20p#mlemodin可以对多种炎症相关效应基因的表达发挥不同程度的调节作用，包括TNF0t、诱生性一氧化氮合酶、IL—lO、抑制蛋白I-kBa、蛋

8、白激酶IKK．a、蛋白激酶IKK吖等；同时emodin还可以减少核因子一kB(nuclearfactor-kappaB)的核易位及p50／p65蛋白的生成量。emodin对前体蛋白p105的调节则与作用时间呈正相关。IKK—a及IKK-7基因沉默后，可导致多种炎症相关基因表达的明显下调，如：TNFIx、iNOS、IL-10、11cBa，同时NF-r。B的核易位也受到抑制。而且，IKK-n的基因沉默将引起IKK．Y表达的代偿性增加，反之亦然。模型组NF-kB活性、iNOSmRNA表达、相应的TNFc／,、NO、iNOS的含量均显著高于假手术组(p

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