月见草油抑制巨噬细胞炎症因子的作用研究

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1、月见草油抑制巨噬细胞炎症因子的作用研究1宁夏医科大学回医药现代化省部共建教育部重点实验室；2宁夏医科大学总医院口腔医院；3宁夏医科大学生育力保持建教育部重点实验室宁夏银川750004【摘要】探讨月见草油对巨噬细胞释放的炎症因子的抑制作用。结果显示月见草油对小鼠巨噬细胞的形态有显著性的改变，抑制脂多糖诱导后释放的炎症因子，RT-PCR结果表明月见草油显著性抑制了环氧合酶-2的表达（p<0.05）,降低了PGE2的表达水平；EUSA结果表明月见草油显著性地抑制和剂量依赖性地减少了一氧化氮合酶（iNOS）和肿瘤坏死因子（TNF-a）减少，白介素-lβ（IL-lβ）的产

2、生（p<0.05）。结果表明月见草油在炎症反应中扮演了保护作用，月见草油是一种功能性治疗药物。.1八.、•刖g只见草油是从只见草（晚樱草）种子中提炼出来的油脂，其含有丰富的多聚不饱和必需脂肪酸，主要成分为γ-次亚麻油酸，已经报道其中ω-6系列必须脂肪酸其有多项治疗作用，对心血管疾病，经前症候群，更年期综合征和糖尿病神经病变等只有疗效（1）。研究报道一氧一氧化氮在炎症反应和免疫反应中扮演重要的作用，巨噬细胞又是常见的一氧化氮合成的主要细胞来源，因此通过脂多糖诱导巨噬细胞iNOS合成，而且巨噬细胞能够产生TNF-a,IL-lβ因子，巨噬细胞激活也可以产

3、生环氧合酶，和前列腺E2（PGE2）,这些因子在炎症反应的病理过程中具有重要的作用（2）,木研究鉴于月见草对巨噬细胞产生的炎症反应报道较少，利用提取的月见草油研究对TNF-a,IL-lβ因子和环氧合酶的影响，1材料和方法1.1材料和试剂月见草汕购自美国公司，含量为，按照比例贮存液溶解在DMSO中，工作液溶解在细胞培养液中.trizonl试剂和RPMI1640培养基购自life-tech公司，鼠iNOS合酶，鼠IL-lβ，鼠TNF-a因子ELISA试剂盒均购自博士德生物公司，western试剂购自Cox-2抗体和PGE2抗体购自博奥森生物公司。1.2巨噬细胞培养及

4、处理按照实验室常规方法，解冻巨噬细胞RAW264.7,用RPMI1640基础培养基补充10%胎牛血清（FΒS）,100iu请链霉素，以1x106个/ml密度接种，在培养箱24孔板中生长过夜，次日换新鲜培养基（5%FΒS）含冇浓度为5ug/ml的LPS，同吋添加不同浓度月见草油，实验分为高浓度组（200ug/ml），中浓度组（100ug/ml），低浓度组（50ug/ml）和空白对照组。1.3细胞增殖活力WST法检测按照文献（4）常规试验方法用WST的方法评价月见草汕对LPS诱导的炎症反应的效果。1.4ELISA法测量—•氧化氮TNF-a减少，白介素-lβ

5、的产生按照文献（2）常规方法分别取lOOul的处理后的细胞培养上清液，按照EUSA试剂盒的操作规程检测iNOS,TNF-a和IL-lβ的吸光度值，利用说明书中标准溶液制备标准曲线，计算出各个处理对应的浓度。1.5RT-PCR检测PGE2和COX-2mRNA表达按照文献（5）常规方法对各组处理的RAW264.7细胞经过Trizonl试剂提取总RNA,经过逆转录和PCR反应，PCR特异性引物分别是：PGE2基因的上游引物5′-TTGACCTCAGCGCTGAGTTG-3′,下游引物5′-CCTGTAGCCCACGTCGTAGC-3&prim

6、e;；C0X-2基因的上游引物5′-CACTACATCCTGACCCACTT-3′,下游引物5′-ATGCTCCTGCTTGAGTATGT-3x；β-actin基因的上游引物5′-GTGGGCCGCCCTAGGCACCAG-3′，下游引物5′-GGAGGAAGAGGATGCGGCAGT-3′oPCR反应条件为95oC7min，94r45s,60-65°C30s,72°Clmin,72°Cl0min,4°Cforever,30个循环。经1.2%琼脂糖凝胶电泳和EΒ染色分析PGE2和

7、cox-2mRNA表达1.6统计方法实验数据以均数±标准差（±SD）表示。并应用SPSS17统计软件系统以T检验及单因素方差分析进行统计分析。检验标准采用P=0.05。2结果不同处理组月见草汕对巨噬细胞生长情况的影响巨噬细胞RAW264.7经过LPS单独诱导后细胞形态固缩，单个细胞变圆,当使用月见草油进行保护吋，细胞形态显著性改变，随月见草浓度的增加，细胞形态逐渐趋于正常，表明月见草汕对产生炎症反应有显著性保护作用。图2月见草油对PGE2和