hgitrptddta融合蛋白的表达与其对人肺腺癌a549细胞株的杀伤作用(7022)

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3、年6日c≤日)．otl年6只

4、∑日分类号殴坌2：!!UDC616编号!Q2窆垒SQ曼!垒Q!Q硕士学位论文hGITR-PTD．DTA融合蛋白的表达及其对人肺腺癌A549细胞株的杀伤作用Expressionofrecombinantfusionp

5、roteinhGITR·-PTD--DTAanditsactivityofkillinghumanlungadenocarcinomaA549cellline作者姓名：指导教师：小组成员：申请学位：学科专业：刘青玲王胜军教授许化溪教授邵启祥教授硕士临床检验诊断学论文提交日期：2011年4月28日论文答辩日期：2011年6月8日学位授予单位：江苏大学学位授予同期：答辩委员会主席：陈瑜教授评阅人：国家自然科学基金资助项目(30871193)、江苏省自然科学基金资助项目(BK2004405)和江苏大学高级人才资助项目(05JDG042)江苏大学硕士学位论文摘要目的：

6、体外表达linkerl连接的hGITR胞外段、跨膜转导结构域(PTD)和白喉毒素A片段(DTA)重组蛋f兰I(hGITR．PTD．DTA)及其对照蛋白PTD．DTA和hGITR．PTD．eGFP，并研究hGITR．PTD．DTA对人肺腺癌A549细胞株的杀伤作用。方法：(1)首先运用PCR扩增技术检测多种人类肿瘤细胞细胞株hGITRLmRNA的表达，流式细胞术检测肿瘤细胞株表面GITRL蛋白的表达。(2)应用PCR技术，以pGEM．T．GITR为模板，扩增获得hGITR胞外段基因；以p22EDTl(含DTA)质粒和pUC57质粒(含有人工合成的linker和P

7、TD氨基酸序列推算出核苷酸序列并在3’端加上SalI和DTA5’端25个核苷酸)同时为模板，扩增获得linker-PTD．DTA基因；以pIRES2一eGFP质粒为模板，获得eGFP基因；对以上扩增获得的目的基因分别进行T-A克隆。’用BamHI和HindIII双酶切hGITR胞外段基因，用肺，zdIII和XhoI双酶切linker-PTD．DTA基因，用BamHI和XhoI双酶切原核表达载体质粒pET32a(+)，连接酶切产物，构建重组质粒pET32a(+)hGITR．PTD．DTA，转化至感受态E．coliDH5a；同时，用HindIII和舰DI双酶切li

8、nker-PTD．DTA基因，和pET32a(+)，连接酶切产物，构建重组质粒pET32a(+)PTD—DTA，转化感受态E．coliDH5a；分别挑取阳性克隆，经双酶切、PCR矛I]基因测序进行鉴定。然后，用SalI和翮oI双酶切eGFPT-A克隆质粒$1JpET32a(+)hGITR-PTD．DTA，连接酶切产物，构建重组质粒pET32a(十)hGITR．I．●hGITR．PTD．DTA融合蛋白的表达及其对人肺腺癌A549细胞株肿的杀伤作用PTD．eGFP，转化感受态E．coliDH5a；挑取阳性克隆，经限制性内切酶BamHI和砌DI双酶切、PCR和基因测

9、序进行鉴定。将构建的表达质粒分别转化ROS表达工程菌，利用IPTG诱导蛋白表达。(3)诱导表达的蛋白hGITR．PTD．DTA、PTD．DTA和hGITR．PTD．eGFP带有His标签，分别通过SDS．PAGE和Westernblot进行鉴定。然后通过Ni+-IMAC柱分别对hGITR—PTD．DTA、PTD．DTA和hGITR．PTD．eGFP进行纯化。(4)将对照蛋白hGITR．PTD．eGFP和人肺腺癌A549细胞株共同孵育，用倒置荧光显微镜观察融合蛋白hGITR．PTD．eGFP和A549细胞的结合情况。(5)采用MTT法测定融合蛋白hGITR—PT

10、D．DTA对肿瘤细胞的体外杀伤活性，利