人乳腺癌细胞cdna噬菌体表达文库的构建与单抗性质的研究

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1、硕士学位论文人乳腺癌细胞eDNA噬菌体表达文库的构建及单抗性质的研究硕士研究生：蔡建中指导老师：罗荣城摘要20世纪∞年代以来，多种入类蒡睾瘸抗原基医克隆的成功，大大推动了肿瘤免疫学理论的发展，也促进了肿瘤免疫诊断和免疫治疗的应用。由于舅孛瘤抗原在肿瘤诊断与治疗中具有重要的靶向作用，因此寻找特异性强、基因功能明确的靶分予成为肿瘤分子生物学的研究热点。近年来，随着分子生物学技术的提高和从细胞受体以及增殖调控的分子水平对肿癯发病机制的进一步认识，开始了针对细胞受体、关键基因和调控分子为靶点的治疗，人们称之为“靶向治疗”。这些领域包括具有靶翔性的表皮生长因子受体(EGFR)阻断剂

2、，针对某些特定细胞标志物的单克隆抗体，针对某些癌基因和癌的细胞遗传学标志的药物，抗秀申瘤盘管生成的药物，抗肿瘤疫苗，基因治疗等等，并在不到10年的时间里有了长的进步。乳腺癌的发生与遗传等因素密切相关，随着分子生物学研究的深入，人们认识到肿瘤是一种基因性疾病。近年来，乳腺癌的发病率日趋增高，在乳腺癌特异抗原标志的众多研究中，除e-erbB．2、EGFR的特异性较高以外，一直未有新的特异性和灵敏度较高的乳腺癌抗原的报道。本课题研究针对我院实验科制各的多株人乳腺癌单壳隆抗体进行免疫学性质的研究，并构建了人乳腺癌细胞eDNA噬菌体表达文库，这将为进一步利用单抗对eDNA文库进行免

3、疫学筛选提供了前期准备。实验结果如下：l。入乳腺癌单抗效价的测定及IgG亚类的签定l中文摘要利用ELISA方法测定抗体的效价，焉琼脂双向扩散鉴定其IgG亚类。测定的六种单克隆抗体(A6、Cs、Hll、E6、H6、C4)的效价分别为1：4000，l：8000，l：32000，l：1000，‘l：2000，其中‰的效价可以达到106。其IgG亚类分别为IgG3，IgGl，IgG3，lgGl，IgGl，IgG3。2。抗人乳腺癌单抗(E6、H6)在各种肿瘤组织中的免疫组化研究利用免疫组织化学链霉菌抗生素蛋白．过氧化物酶(SP)法检测3例正常入组织，48侧蒡孛瘤患者组织，其中包括乳

4、腺、霄、结肠、肺腺癌各重2例。正常组织里阴性染色，肿瘤组织呈现细胞膜和细胞浆阳性着色，E6阳性表达率在襞腺癌中为100％<12／12)，在莠孛癯组织中综合表达率为94％(45／48)，H6阳性表达率在乳腺癌中为92％(11／12)，在肿瘤组织中综合表达率为83％(40／48)。3．人乳腺癌单克隆抗体对应抗原蛋白免疫印迹分析扶乳腺癌组织孛提出抗原蛋自质，运用抗原对应抗体进行免疫露迹实验，并以正常小鼠血清为蛋白标准。结果中作为蛋白标准的小鼠正常血清仅出现两条条带，其中一条为重链，分子量为54kD，另外一条为轻链，分子量为27kD。蛋白样品仅出现～条条带，无非特异性条带，通过计

5、算其分子量为46．414kD。4．人乳腺癌细胞cDNA噬菌体文库的构建及鉴定用SMART技术，构建了人乳腺癌细胞cDNA噬菌体文库，从人乳腺癌细胞中分离总RNA并纯化mRNA，利用经修饰的oligo(dT)引物合成cDNA第一链，利用SMA灯核营酸作势cDNA第一链在mRNA5’端延{率蹴去的模板，采用LD．PCR合成双链cDNA，双链cDNA经酶切和过柱分级分离詹，克隆入爻．TriplEx2载体后经体外包装面成cDNA文库。原始人乳腺癌细胞cDNA噬菌体表达文库获得1．57×107个重组子，重组率达到98％。文库扩增后，滴度达到4．0x10擎pfu／ml，插入cDNA平

6、均长度为2．5kb。关键词：人乳腺癌萃克隆抗体免疫学性质cDNA文库ll硕士学位论文ConstructionofhumanbreastcancercellscDNAphageexpressionlibraryandstudyofthecharacteristicSofmonoclonal』●l■●antlD0clleSName：CaiJianzhongSupervisor：LuoRongchengABSTRACTStartinginthe1990s，thedevelopmentoftumorimmunologyandtheapplicationoftumorimmunod

7、iagnosticsandimmunotherapyhasbeendrivenforwardbythesuccessfulcloningofmanytypesofhumantumorantigengenes．Antigenshaveallimportanttargetingroleinthediagnosisandtreatmentoftumors，SOsearchingforatargetmoleculeswithstrongspecificityanddefinitegenefunctionhasbecomeanimpor