鸡胚成纤维细胞cDNA表达文库的构建

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1、!"卷#期微生物学报!（"#）：!’#(!’"$%%"年&月!日!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$!)*+,$%%"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!鸡胚成纤维细胞!"#$表达文库的构建’，$’’’，#"$刘伟，高玉龙，高宏雷，王笑梅，许修宏（’中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨’.%%%’）（$东北农业大学资源与环境学院微生物系哈尔滨’.%%#%）（#黑龙江省农业科学院博士后科研工作站哈尔滨’.%%%’）摘要：鸡胚成纤维细胞（

2、/85）是研究鸡传染性法氏囊病病毒（E0FG）的主要细胞材料，而构建/85的AFHI表达文库是筛选E0FG在/85中的细胞受体，研究细胞嗜性的基础平台。采用J6K,;6L技术构建/85的表达文库，避免使用限制性内切酶切割AFHI，能够解决常规方法构建AFHI文库的技术缺陷。该技术将/85的9MHI分离纯化后，以.N端生物素标记的O2:PD（Q1）R?:9,?为引物反转录后连接IQ6RK,?，层析柱纯化，通过0S重组反应构建AFHI入门文库，其平均滴度为’C’T’%&"AU*V9W，文库总容量为’C$T’%AU*，平均插入片段为$$!#XR，重组率为’%%Y。通过WM重组反

3、应将入门文库转换为表达文库，经测定平均滴度为.T’%.&AU*V9W，文库总容量为.C.T’%AU*，平均插入片段为$!’’XR，重组率为’%%Y。结果表明，所构建的文库具有较高的重组率和较大的库容量，可作为较高质量的文库来研究E0FG的相关基因，为研究病毒受体和病毒入侵途径，进一步了解E0FG的致病机理奠定了基础。关键词：鸡胚成纤维细胞（/85）；J6K,;6L技术；AFHI表达文库；传染性法氏囊病病毒（E0FG）中图分类号：Z"3文献标识码：I文章编号：%%%’4&$%-（$%%"）%#4%!’#4%.鸡传染性法氏囊病（!"#$%&’()*+),*-./’*$-*$，

4、J6K,;6L技术是一种新的通用型克隆系统，它整E0F）是由鸡传染性法氏囊病病毒（!"#$%&’()*+),*-.合了各种克隆载体的技术平台，可加快达到最终研/’*$-*$0’,)*，E0FG）引起的一种危害鸡的急性、高度究目标的速度。该技术克服了其它技术常用的两种接触性传染病。E0FG主要侵染幼鸡未成熟的0淋方法：酶切和连接、S/M产品克隆等相关的制约因巴细胞，#(&周龄的幼鸡为易感鸡群，年龄较大的素。J6K,;6L技术基于已被详尽研究的!噬菌体位鸡具有一定抵抗力，小于#周龄的雏鸡感染后会产点特异性重组系统，使得在不同的克隆载体之间转［’(#］生严重的免疫抑制，但不表现

5、临床症状。迄今，移FHI片段、保持基因定位和阅读框架及有效地取此病在世界范围内均有报道，我国的流行情况也十代使用限制性内切酶和连接酶进行克隆和亚克隆的分复杂，变异株和超强毒株均有报道，使养禽业承受方法成为可能，具有简单快速、克隆效率高、方便灵［"］重大经济损失。活等特点。E0FG感染鸡体的主要靶器官是法氏囊，主要靶鸡胚成纤维细胞（/85）是实验常用的细胞原料［!］细胞是0淋巴细胞。E0FG的超强毒株只适应鸡之一，也是研究E0FG的主要细胞材料，因此鸡胚成的0淋巴细胞，但其可通过鸡胚传代的方法致弱。纤维细胞AFHI文库对研究E0FG具有广泛的应用超强毒株（>>E0FG）的致

6、弱与细胞嗜性的改变相伴而价值。本试验运用J6K,;6L技术成功构建了鸡胚成［.］生，致弱后的毒株可以在鸡胚成纤维细胞（/85）纤维细胞的AFHI表达文库，为进一步研究E0FG在上增殖。本实验室已将>>E0FGJ7株经过在鸡胚上鸡胚成纤维细胞中的病毒受体及其细胞嗜性提供了传.代、/85上传$%代获得相应的致弱疫苗株JK理论物质基础，同时也为研究其它适应于鸡胚成纤［&］［3］株。0?6+QK等研究表明，E0FG超强毒株在/85维细胞上生长的病毒提供可靠的试验基础。细胞没有受体，在其传代致弱过程中，GS$基因的几%材料和方法处核苷酸改变导致其细胞嗜性的改变，然而致弱毒株与/85

7、细胞如何作用及病毒的/85细胞受体还%&%材料未见相关报道。%&%&%[S5鸡胚：试验所用[S5鸡胚由中国农业科基金项目：国家“-"#项目”（$%%./0.$#$%$）"通讯作者。1,2：3&4!.’43.-#.%!"；567：3&4!.’43$"&$.’%；8496:2：79;<=>?:@6A@A+作者简介：刘伟（’-"-B），男，黑龙江牡丹江人，硕士研究生，主要从事动物分子病毒学与免疫学研究。8496:2：2;4"-%&’#<’$&CAD9收稿日期：$%%&4%-4’#；接受日期：$%%&4’%4$%；修回日期：$%%"4