十种中药成分对鸡胚成纤维细胞生长的影响

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1、十种中药成分对鸡胚成纤维细胞生长的影响+胡元亮孔祥峰张宝康刘家国王德云(南京农业大学中兽医学研究室江苏南京210095)摘要：为了筛选免疫增强作用较好的中药成分，为研制新型免疫增强剂提供理论依据，选择当归多糖(CAPS)、黄芪多糖(APS)、板蓝根多糖(IRPS)、淫羊藿多糖(EPS)、蜂胶多糖(PPS)、淫羊藿黄酮(EF)、蜂胶黄酮(PF)、黄芪黄酮(AF)、黄芪皂甙(AS)和人参皂甙(GS)等10种中药成分为研究对象，在提取制备并测定它们对体外培养的鸡胚成纤维细胞(CEF)的安全浓度的基础上，分别稀释成5种浓度，与CEF一起加人到96孔

2、细胞培养板中培养，分别在培养24、36、48、60、72h时用MTr法测定各中药成分对CEF增殖的影响。结果表明，所有中药成分均能不同程度地促进CEF增殖，并有一定的量效和时效关系。关键词：中药成分；鸡胚；成纤维细胞；细胞培养法黄芪、当归、板蓝根、淫羊藿、蜂胶和人参是常用的补虚中药，研究表明，其中许多成分具有免疫增强作用”41。在以前的研究中，笔者提取了黄芪多糖(astragaluspolysac-charide，APS)、当归多糖(Chinese∞gcncapolysaccharide，CAPS)、蜂胶多糖(propolispolysac

3、cha-ride，PPS)、淫羊藿多糖(epimediumpolysaecharide，EPS)、板蓝根多糖(isatisrootpolysaccharide，IRPS)、黄芪黄酮(astragalusflavone，AF)、蜂胶黄酮(propolisflavone，PF)、淫羊藿黄酮(epimediumflavone，EF)、黄芪皂甙(astragalussaponin，AS)和人参皂甙(ginsenoside，GS)等10种中药成分，用细胞培养法测定了它们对体外培养鸡胚成纤维细胞(CEF)的安全浓度Ⅲ。本研究进一步测定了安全浓度范围内的

4、lO种中药成分对CEF增殖的影响，旨在对它们进行全面评价．以筛选出免疫增强作用较好的中药成分，为研制新型免疫增强剂提供理论依据。1材料与方法1．1试验药物APS、CAPS、PPS、EPS和IRPS，用水煎醇沉法提取，硫酸蒽酮法测定含量；AF、PF和EF，分别用聚酰胺柱层析法(AF和EF)和酸碱沉淀法(PF)提取，用芦丁法测定含量。AS和GS，用大孔吸附树脂柱层析法提取，TLC．分光广度法澳0定含量。以上10种中药成分，根据对CEF安全浓度的测定结果，分别用细胞维持液稀释成5个不同浓度(见结果中各表浓度栏)．常规潸毒后备用。·基金项目：国家自

5、然科学基金资助项目(30070566)作者简介：胡元亮(1953一)，男，教授，博士，博士研究生导师。·257·1．2主要试剂MEM培养基，Gibco公司产品，按说明书配制，再加入谷胺酰氨(0．03％)、双抗(100IU／m1)和犊牛血清(达5％为细胞生长液，达2％为细胞维持液)；胰蛋白酶，科威公司进口分装，称取O．259溶于100mlPBS中，调节pn值至7．4，0．22Itm混合纤维素酯微孔滤膜过滤除菌，分装，一20℃保存备用；四唑盐(MTT)，Sigma公司产品，用o．01mol／LPBS(pa7．4)溶解成2％溶液，0．22um混合

6、纤维素酯微孔滤膜过滤除菌，分装，4。C避光保存，1个月内用完”)；裂解液，二甲亚砜(DSMO)，分析纯。1．3主要仪器c02培养箱，美国Revco公司产品；倒置显微镜，重庆光学仪器厂产品：DG3022型酶联免疫检测仪，国营华东电子管厂产品；细胞培养瓶、96孔细胞培养板和6孔细胞培养板，科威公司产品。1．4实验方法根据文献15o中介绍的方法制备CEF。将细胞数调至5×t05个／ml后加到96孔培养板中，每孔100u1；随后分组加药，实验组加入各种浓度的中药成分，每孔100ul，每种浓度4孔；对照组，每种药物设4孔，加入等量细胞生长液；另设一无

7、细胞孔作为测定时的空白调零孔；均同时重复5块细胞板；然后置37。C，5％C02培养箱中培养，分别在培养24、36、48、60、72h时各取1块细胞板测定细胞增殖情况。1．5细胞增殖测定方法用MTT法t6]。即，在测定前4h每孔加入30p1MTT，继续培养；测定时取出培养板，快速翻转．甩去孔内培养液，每孔加入150ul裂解液，室温震荡10min使结晶物溶解，然后用酶联免疫检测仪测定570nm波长下光密度(oD)值，作为细胞增殖的指标。数据用SPSS软件统计分析，比较同期各组细胞增殖的差异性。2结果与分析2．1APS对CEF增殖的影晌60h时各

8、浓度组的OD值均显著大于对照组，其余时间点高浓度组的OD值多小于或显著小于对照组，低浓度组在36h稍大于对照组，说明APS在60h时显著促进细胞增殖．低浓度时前期促进增殖(表1)