屋尘螨cdna表达文库的构建及初步鉴定

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1、屋尘螨cDNA表达文库的构建及初步鉴定作者：刘良，彭江龙，周鹰，崔玉宝【摘要】目的：构建屋尘螨cDNA表达文库.方法：用RNAisoReagent试剂盒提取屋尘螨TotalRNA，用PolyATtractmRNA分离试剂盒提取mRNA，用Clontech公司SMARTTMPCRcDNAlibrarykit反转录合成第1链cDNA，用LDPCR合成第2链cDNA并扩增，PCR产物与MaxPlaxTM试剂盒体外连接包装，建成未扩增的cDNA文库，计算其滴度和重组效率后进行文库扩增并测定扩增文库的滴度.结果：cDNA文库未扩增时滴度为9.148×106，重组效率达93.88%以上，文

2、库扩增后滴度为7.628×109，插入片段平均1.63kb.结论：成功地构建了高质量的屋尘螨cDNA表达文库.【关键词】欧洲屋尘螨，基因文库0引言　　随着现代分子生物学技术的发展，应用基因工程变应原诊断和治疗变态反应性疾病已成为当代变态反应学研究的主流.研究表明，基因工程技术通过减少重组变应原IgE结合的抗原表位，能有效地降低IgE介导的过敏反应，同时通过保留变应原T细胞识别所必须的结构域，因而具有较好的免疫原性，减少免疫治疗的危险性，可以提高脱敏治疗的效果［1-2］.　　制备基因工程变应原的前提是获取目的基因.从理论上讲，研究者可从一个合格的基因文库中调取任何目的基因，是发现并

3、获取特异性基因克隆应用于重组变应原研究的有效方法之一.本研究采用Clontech公司Smart方法构建屋尘螨cDNA表达文库，为系统地研究屋尘螨的基因结构和功能、进一步制备尘螨基因工程变应原奠定基础.1材料和方法1.1材料SMARTTMPCRcDNAlibrarykit为美国Clontech公司产品，RNAisoReagent，TranscriptRNACleanUpKit均购自日本TaKaRa公司，polyATtractmRNA分离试剂盒由美国Promega公司生产.OligodT纤维素、MMLV反转录酶和MaxPlaxTMLambdaPackagingExtract购自德国

4、Eicentretechnologies公司，其余试剂为国产分析纯.TP3000PCR仪（Takara），Mupid电泳仪(AdvancebioCo.,Ltd)，ImageMasterVDS电泳成像装置（PharmaciaBiotech），ABIPrismTM377XLDNASequencerDNA测序仪（PerkinElmer）.1.2方法1.2.1cDNA文库的构建解剖镜下挑取屋尘螨约200只，匀浆后用TaKaRaRNAisoReagent试剂盒提取TotalRNA，用PolyATtractmRNA分离试剂盒提取mRNA，操作按说明书进行.参照试剂盒说明书，cDNA文库的

5、构建以mRNA为模板，SmartⅢOligonucleotid(dT)为引物，在MMLV反转录酶作用下合成cDNA第1链；加入dNTPs，5PCRPrimer，3PCRPrimer和AdvantageⅡ聚合酶，置基因扩增仪上用长距离PCR(LDPCR)合成得双链DNA，取PCR产物5μL用琼脂糖凝胶电泳检测，以鉴定双链DNA分布范围.经蛋白酶K灭活、SfiⅠ酶切、过柱(Chro2Maspin400)分级分离后，连续收集12个单滴组分，每组分取2μL进行琼脂糖凝胶电泳，收集前4个含有cDNA的组分，用乙醇沉淀回收.按照cDNA∶Vector=1∶2/1∶1/2∶1三种方式进行

6、连接，用MaxPlaxTM试剂盒对连接产物进行体外包装，至此建屋尘螨cDNA未扩增文库.1.2.2未扩增文库滴度测定取3种连接方式稀释度为1∶5，1∶10和1∶20的包装产物各1μL，分别与过夜液体培养物200μL混合，并加入融化的LB/MgSO4TopAgar3mL，快速倒在37℃预热的90mmLB/MgSO4平板，快速旋转平板，使TopAgar水平分布，室温冷却10min后置37℃倒置培养6~18h.统计噬菌斑，计算滴度pfu/mL=噬菌斑数×稀释因子×103/铺板体积(μL).利用IPTG和XGal诱导上述未扩增文库计数蓝、白斑，重组效率=白斑数/(白斑数+蓝斑数).1.

7、2.3扩增文库滴度计算在10mL试管中加入过夜培养的XL1Blue菌液500μL和足够的噬菌体液(未扩增文库)，在37℃水浴15min后，每管加入融化的LB/MgSO4TopAgar9mL，快速混匀铺板，室温冷却后置37℃倒置培养至噬菌斑长满，每块平板加入1×λ稀释液12mL，4℃过夜，以得到已扩增文库的裂解液；将平板在脱色摇台上室温50r/min1h，用灭菌烧杯收集平板中的噬菌体裂解液，充分混匀后分装于50mL灭菌离心管，每管加入氯仿10mL，盖紧，振荡混匀2min，7000