人大肠癌抗原基因 cdna噬菌体表达文库的构建和鉴定

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1、人大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库的构建和鉴定【摘要】　　目的:为获得大肠癌的特异性抗原基因,构建人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库。方法:从2株人大肠癌细胞CCL187和CX1中提取总RNA,分离纯化mRNA,并以此为模板合成第1链cDNA,用置换法合成第2链cDNA。双链cDNA经末端削平、EcoRⅠ接头连接、XhoⅠ酶切、过柱分级分离,除去<400bp片段。收集符合需要的cDNA片段与噬菌体ZAPExpress载体连接,体外包装后获得人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库。结果:构建的人大肠癌抗原基因的cD

2、NA噬菌体文库,原始库容量为2.3×109pfu/L,重组率97%。重组子插入cDNA片段平均大小1kb以上。结论:成功地构建高质量的人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库,为大肠癌的特异性抗原筛选奠定了基础。【关键词】人大肠癌;噬菌体;cDNA表达文库　　［Abstract］AIM:ToconstructacDNAphageexpressionlibraryofcolorectalcarcinomaantigensforscreeningcolorectalcarcinomaspecificantigens.METHODS:Th

3、etotalRNAtacelllinesCCL187andCX1.ThemRNAfromtotalRNAinierase.ThebluntedcDNAsallcDNAmolecules（<400bp）ovedthroughsizefraction.AfterthecDNAsaryentacDNAphageexpressionlibraryisexcellentandhelpfultoscreencolorectalcarcinomaspecificantigens.　　［Keya;bacteriophage;cDNAexp

4、ressionlibrary　　大肠癌是消化系统的常见恶性肿瘤之一,死亡率有逐年上升的趋势。因此早期诊断和治疗是提高大肠癌治愈率的关键［1］。我们已成功制备了以人大肠癌细胞系CCL187为免疫源的鼠抗人大肠癌单克隆抗体(mAb)ND1［2］,进一步筛选和鉴定ND1mAb所识别的特异性大肠癌抗原,可为大肠癌早期诊断和免疫治疗提供新的靶点。而寻找抗原基因的最有效方法是构建cDNA文库,继而进行筛选、克隆。国内外已开展大肠癌cDNA文库构建和大肠癌相关肿瘤抗原筛选方面的研究［3,4］。本实验中用2株人大肠癌细胞系CCL187和CX

5、1作为构建文库的材料,以λZAPExpress为载体,构建了人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库。　　1材料和方法　　1.1材料CCL187和CX1人大肠癌细胞株由美国哈佛大学医学院肿瘤所惠赠。TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司;DMEM培养基购自Gibco公司;mRNA分离纯化试剂盒购自德国Qiagen公司;ZAPExpresscDNASynthesisKit和ZAPExpresscDNAGigapackIIIGoldCloningKit购自美国Stratagene公司。LB培养基胰蛋白冻、酵母提取物购自Oxo

6、idLTD;盐酸四环素购自Amresco公司;异丙基硫代βD半乳糖苷(IPTG)、5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷(Xgal)为TaKaRa公司产品。　　1.2方法　　1.2.1RNA提取和纯化培养人大肠癌细胞CCL187和CX1至对数生长期,倒去培养液,用PBS冲洗后加入TRIzol试剂,裂解细胞并抽提总RNA,用Qiagen的mRNA分离纯化试剂盒分离纯化mRNA,用紫外分光光度计测定其A260/A280比值及含量,用MOPS甲醛变性凝胶电泳观察完整性。　　1.2.2cDNA合成按Stratagene公司试

7、剂盒说明书进行。取5μg纯化的mRNA样品作为模板,用50个碱基的寡聚核苷酸为合成引物,序列为5′GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′（下划线处为XhoI酶切位点）,加逆转录酶StrataScriptRT（MMLV）,混匀后42℃水浴1h,逆转录合成cDNA第1链。置换法用RNaseH将mRNA降解成小片段作为引物合成cDNA第2链。合成的cDNA第1链取5μL,第2链取1μL用于电泳观察片段大小。双链合成后经PfuDNA聚合酶将链末端补平,末端补平的cDNA上

8、下游与EcoRⅠ适配子接头连接,再将EcoRⅠ适配子的5′末端磷酸化,用XhoⅠ酶切消化,生成的cDNA分子一端带有XhoI黏性末端,另一端带有EcoRI黏性末端。此cDNA产物经SepharoseCL2B层析柱按分子