应用特异性噬菌体抗体克隆和筛选新的大肠癌抗原基因论文

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1、应用特异性噬菌体抗体克隆和筛选新的大肠癌抗原基因论文【关键词】大肠癌摘要：目的构建人大肠癌细胞cDNA表达文库，用抗人大肠癌噬菌体抗体CH209筛选新的大肠癌抗原基因。方法抽提人大肠癌细胞HRT18的总RNA后分离mRNA，利用SMART(Sat5thendofRNATranscript)技术合成cDNA，与λTripIEx2载体连接包装成cDNA文库。测定原始文库的滴度和文库重组率，鉴定插入片段的大小，测定扩增文库库容量并鉴定CH209筛选的阳性克隆。结果原始文库滴度为6.5×106pfu/mL，重组率为97%；插入片段的大小介于0.5-2.0kb之间；扩增文库滴度为1.1×109pfu/

2、mL，筛选后获得10个阳性克隆.freelancolorectalcancercellHRT18,a.MethodsTotalRNAcellHRT18andmRNAtotalRNAandthendoublestrandcDNAarylibraryined.ThelengthofcDNAinsertsined.ResultsTheprimarylibraryconsistedof6.5×106pfu/mL,andthepercentageofrebinantclonesplifiedcDNAlibraryL.Tenpositiveclonestendifferentgenes.Fiveofth

3、esegenesologoustogenesknoologytogenesknoaindertightbenovelgenesbymatchinginGenBankhumanCRCcellHRT18isexcellent.Tenpositiveclonesmaybenovelgenes.KEYART(Sat5thendofRNATranscript)技术，构建了大肠癌细胞HRT18的cDNA文库，并用抗大肠癌单链抗体CH209对文库进行免疫学筛选及鉴定大肠癌及其相关肿瘤抗原，拟为大肠癌肿瘤疫苗的研制提供候选抗原，也有可能为大肠癌早期诊断提供血清学分子标志物。1材料与方法1.1材料总RNA抽提

4、试剂TRIzol为Invitrogen公司产品，SMARTTMcDNA文库构建试剂盒购自Clotech公司，mRNA纯化试剂盒及PackagenLambdaDNAPackingsystem均购自Promega公司。RPMI1640细胞培养基为华美公司产品，小牛血清购自杭州四季青公司，琼脂糖和细菌培养基均为Gibco/BRL公司产品，余为常规试剂。HRT18人大肠癌细胞株来源于人直肠肛门腺癌组织，为本室保存。采用λTripIEX2载体及大肠杆菌XL1Blue。硝酸纤维素膜购自浙江台洲四甲生化塑料制品厂。抗大肠癌噬菌体人抗体CH209为本室制备。HRP标记的羊抗M13单克隆抗体(HRPantiM

5、13)购自PharmaciaBiotech公司。λTripIEx2插入子筛选引物：5′端引物5′CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT3′，3′端引物5′ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCC3′。AgaroseGelDNAPurificationKit为上海生工生物工程公司产品。1.2大肠癌细胞HRT18mRNA的提取人大肠癌细胞株HRT18总RNA抽提按照TRIzol试剂操作说明进行，按每107个细胞加入1mLTRIzol混匀，氯仿抽提、乙醇沉淀和室温干燥后，总RNA溶于无RNase的去离子水中，经紫外分光光度计测定其A260，A280吸光度值鉴定纯度，以

6、浓度为11g/L琼脂糖凝胶电泳证实其完整性后，65℃加热10min后，加入生物素标记的Oligo(dT)探针及可结合生物素的磁珠(SMPMAS)与mRNA杂交形成杂交体，磁性吸附将杂交体从总RNA中分离，经洗脱后溶于无RNase的去离子水中，所得mRNA用于合成cDNA。1.3cDNA的合成及酶切以纯化的mRNA为模板，用含有SfiⅠ酶切位点的SMARTⅢ寡核苷酸和CDSⅢ/3′PCR引物合成cDNA第一链，再以CDSⅢ/3′PCR引物和5′PCR引物经LDPCR扩增合成双链cDNA。双链cDNA经SfiⅠ酶切后，Chromaspin400凝胶过滤柱对cDNA进行凝胶过滤层析，分步收集样品，

7、合并较大的cDNA片段。1.4cDNA的包装及文库的扩增将cDNA与载体λTripIEX2按1∶1比例连接，采用PackagenLambdaDNAPackingsystem(Promega公司)试剂盒进行包装形成噬菌体颗粒。培养XL1Blue宿主菌，用包装产物感染宿主菌，铺于琼脂平板，根据噬斑数计算文库的滴度。按照文库的滴度，继续感染宿主菌，以扩增文库。在扩增的文库加入二甲基亚砜，使其体积分数为7%，于-70