屋尘螨cdna表达文库的构建及初步鉴定论文

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1、屋尘螨cDNA表达文库的构建及初步鉴定论文刘良，彭江龙，周鹰，崔玉宝【摘要】目的：构建屋尘螨cDNA表达文库.方法：用RNAisoReagent试剂盒提取屋尘螨TotalRNA，用PolyATtractmRNA分离试剂盒提取mRNA，用Clontech公司SMARTTMPCRcDNAlibrarykit反转录合成第1链cDNA，用LDPCR合成第2链cDNA并扩增，PCR产物与MaxPlaxTM试剂盒体外连接包装.freelart方法构建屋尘螨cDNA表达文库，为系统地研究屋尘螨的基因结构和功能、进一步制备尘螨基因工程变应原奠定基础

2、.1材料和方法1.1材料SMARTTMPCRcDNAlibrarykit为美国Clontech公司产品，RNAisoReagent，TranscriptRNACleanUpKit均购自日本TaKaRa公司，polyATtractmRNA分离试剂盒由美国Promega公司生产.OligodT纤维素、MMLV反转录酶和MaxPlaxTMLambdaPackagingExtract购自德国Eicentretechnologies公司，其余试剂为国产分析纯.TP3000PCR仪（Takara），Mupid电泳仪(AdvancebioCo.

3、,Ltd)，ImageMasterVDS电泳成像装置（PharmaciaBiotech），ABIPrismTM377XLDNASequencerDNA测序仪（PerkinElmer）.1.2方法1.2.1cDNA文库的构建解剖镜下挑取屋尘螨约200只，匀浆后用TaKaRaRNAisoReagent试剂盒提取TotalRNA，用PolyATtractmRNA分离试剂盒提取mRNA，操作按说明书进行.参照试剂盒说明书，cDNA文库的构建以mRNA为模板，SmartⅢOligonucleotid(dT)为引物，在MMLV反转录酶作用下合成

4、cDNA第1链；加入dNTPs，5PCRPrimer，3PCRPrimer和AdvantageⅡ聚合酶，置基因扩增仪上用长距离PCR(LDPCR)合成得双链DNA，取PCR产物5μL用琼脂糖凝胶电泳检测，以鉴定双链DNA分布范围.经蛋白酶K灭活、SfiⅠ酶切、过柱(Chro2Maspin400)分级分离后，连续收集12个单滴组分，每组分取2μL进行琼脂糖凝胶电泳，收集前4个含有cDNA的组分，用乙醇沉淀回收.按照cDNA∶Vector=1∶2/1∶1/2∶1三种方式进行连接，用MaxPlaxTM试剂盒对连接产物进行体外包装，至此

5、建屋尘螨cDNA未扩增文库.1.2.2未扩增文库滴度测定取3种连接方式稀释度为1∶5，1∶10和1∶20的包装产物各1μL，分别与过夜液体培养物200μL混合，并加入融化的LB/MgSO4TopAgar3mL，快速倒在37℃预热的90mmLB/MgSO4平板，快速旋转平板，使TopAgar水平分布，室温冷却10min后置37℃倒置培养6~18h.统计噬菌斑，计算滴度pfu/mL=噬菌斑数×稀释因子×103/铺板体积(μL).利用IPTG和XGal诱导上述未扩增文库计数蓝、白斑，重组效率=白斑数/(白斑数+蓝斑数).1.2.3扩增文库

6、滴度计算在10mL试管中加入过夜培养的XL1Blue菌液500μL和足够的噬菌体液(未扩增文库)，在37℃水浴15min后，每管加入融化的LB/MgSO4TopAgar9mL，快速混匀铺板，室温冷却后置37℃倒置培养至噬菌斑长满，每块平板加入1×λ稀释液12mL，4℃过夜，以得到已扩增文库的裂解液；将平板在脱色摇台上室温50r/min1h，用灭菌烧杯收集平板中的噬菌体裂解液，充分混匀后分装于50mL灭菌离心管，每管加入氯仿10mL，盖紧，振荡混匀2min，7000r/min离心10min，收集上清液，4℃保存.扩增文库滴度计算方法同

7、上，所选用的噬菌体裂解液稀释度为10-4，铺板体积为5μL/12mm.1.2.4文库的PCR鉴定随机挑取12个单克隆噬菌斑分别加入到装有100μL1×λ稀释缓冲液的管中，并加入XL1Blue菌的过夜培养物200μL，制备DNA模板.根据克隆位点两端的序列设计并委托上海生物工程公司合成引物P1(5′CTCCGAGATCTGGACGAGC3′)和引物P2(5′TAATACGACTCACTATAGGG3′).PCR反应体积为50μL，具体如下：DNA模板6μL，引物P1和P2各1μL(10μmol/L)，10×Advantage2

8、PCRBuffer5μL，10mmol/LdNTPMix2μL，50×Advantage2PolymeraseMix及ddH2O34.6μL.反应条件：95℃预变性1min，95℃50s，56℃50s，72℃1min，共