鱼类病毒性神经坏死病毒的分离和部分特性的研究

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1、摘要鱼类病毒性神经坏死病(Viralnervousnecrosis，简称VNN)又称病毒性脑病和视网膜病(Viralencephalopathyandretinopathy，VER)，是由鱼类病毒性神经坏死病毒(Ⅵralnervousnecrosisvirus，简称VNNV，属于乙型野田村病毒属)引起的一种新的传染性疾病。是世界范围的一种鱼类流行性传染病，该病最早于1985年报道于日本，现已遍及非洲外的所有地方。该病临床上主要以鱼苗出现神经异常为特征，表现为不正常游泳：螺旋状游动、在水中打转、腹部向上浮于水面；组织病理以患病鱼中枢神经系统和视网膜中间层出现空泡为特征。中国台湾和广州分别从

2、1997年和2001年开始报道此病，目前已对我国水产养殖业造成严重危害。国内关于VNNV的报道集中在病理切片和核酸序列分析上，而关于此病毒在条纹月醴细胞系(stripedsnakehead，SSNl)分离培养及理化特性方面的报道较少。从福建厦门收集发病青斑病料经处理接种SSNl细胞，设定不同温度增值病毒。通过制备病理切片、观察细胞病变(cytopathiceffects，CPE)、PCR扩增VNNV部分核酸片段和电镜观察来确定分离物是否为VNNV。结果通过病理切片可以在病鱼视网膜中看到大量空泡化现象，接种的SSNl细胞在25℃培养2--3天表现出CPE，PCR检测结果为VNNV核酸阳性，

3、电镜观察细胞切片显示有大量病毒粒子排列在感染的SSNl细胞质中，负染可以看到其为直径25--30nm的二十面体，无囊膜。综上表明所分离的为VNNV。随后对其一些特性进行研究。该病毒在SSNl细胞中25℃时滴度可以达到105一／0．1mL．石斑鱼吻端细胞系(grouperproboscis，GP)、鲤鱼上皮瘤细胞系(epithelimapopuasumcuprini，EPC)、肥头鲤细胞系(pimephalespromelas，FHM)在28℃、25℃、20℃时对该病毒都没有CPE，且PCR检测VNNV核酸为阴性。病毒经55℃30min、pH=3和pH-ll各1h处理后下降2个滴度，经氯仿

4、处理后滴度不变。以上说明GP、EPC、FHM这些细胞对该病毒都不敏感；该病毒对热(55"C30min)和酸碱(pH=3和pH-11)都比较敏感；对氯仿不敏感说明病毒没有囊膜，符合VNNV的形态特征。此研究从VNNV培养温度及SSNl细胞培养环境等方面为制定细胞分离培养VNNV规程提供了一定的数据依据，具有一定的诊断意义。另外这是在我国首次借助SSNl细胞报道了VNNV的理化特性，为养殖场环境控制提供了一定的理论依据。关键词病毒性神经坏死病毒；病毒分离；病毒特性；SSNlnAbstractⅥralencephalopathyandretinopathytVER)，orviralnervou

5、snecrosis(VNN)iscausedbyviralnervousnecrosisvirus(VNNV)whichbelongstoamemberof13-nodaviridae．ItwasanewinfectiousfishdiseaseandfirstreportedinJapanin1985．Nowithasbeenreportedasaseriousdiseaseoflarval，juvenileandsometimesoldermarinefish．ThediseaseOCCURSalmostworld—wideexceptAfrica．Youngerfishhasmor

6、eseverelesionthanolder,themortalitysometimesreached100％inaweek．thediseaseischaracterisedbyavarietyofneurologicalabnormalities，suchaserraticswimmingbehaviour(spiral，whirlingorbelly—upatrest)andvacuolationofthecentralnervoustissues．ChinareportedtheVERfrom1997inTaiwanandfrom2001inmainlandandmainlyfo

7、cusedonhistopathologicalsection，nucleotidesequenceanalysisofthevirus．ThereareonlyafewacademicthesisestostudytheVNNVusingcellcultureinChina,toenrichtheresearchcontentaboutvirusisolation，thisexperimentWasdeveloped．．Aviru