利用鱼类细胞系筛选抗神经坏死病毒（nnv）中草药的研究

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1、学校代码：10264研究生学号：M120104144上海海洋大学硕士学位论文利用鱼类细胞系筛选抗神经坏死病毒题目：（NNV）中草药的研究ScreeningChineseherbsforAntiNervous英文题目：NecrosisVirus(NNV)byusingfishcelllines专业：临床兽医学研究领域：水产动物疾病姓名：马荣荣指导教师：杨先乐教授王印庚研究员二O一五年五月二十五日上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文

2、中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海水产大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学

3、位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注沈锦玉浙江省淡水水产研究所研究员主席吕利群上海海洋大学教授委员胡鲲上海海洋大学副教授委员喻文娟上海海洋大学讲师秘书答辩地点生命学院D楼101答辩日期2015.6.7上海海洋大学硕士学位论文利用鱼类细胞系筛选抗神经坏死病毒（NNV）中草药的研究摘要石斑鱼广泛分布于热带和亚热带海域，是我国重要的海洋经济鱼类。然而在石斑鱼繁育生产过程中，病毒性神经坏死病（VNN）常引起石斑鱼仔稚鱼发生大规模死亡事件，死亡率常高

4、达90%。VNN目前并没有有效的防治措施，而中草药具有低毒、无残留等优点，符合开发无公害渔药的特点，因此筛选抗神经坏死病毒（NNV）的中草药具有广阔的应用前景。在药物筛选的载体选择中，细胞系取自于生物体，生物性能基本接近生物个体特性，相比其他药物筛选载体，细胞系可进行高通量筛选，符合现代细胞生物学技术的发展趋势。故利用鱼类细胞系筛选抗NNV中草药具有一定的实践和理论价值。2013年5月份，山东省某繁育场培育的珍珠龙胆石斑鱼鱼苗由于感染了NNV而出现了大量死亡，给该繁育场带来了严重的经济损失。本论文对导致鱼苗患病死亡的病原进行了鉴定及测序分

5、析，并利用健康珍珠龙胆石斑鱼的脑组织进行了细胞系建系工作，初步探讨了该细胞系与NNV的关系。在此基础上，又利用建立的脑组织PB细胞系和SSN-1细胞系进行了抗NNV中草药的筛选工作。本论文有如下主要研究结果：1疾病病原鉴定及基因测序分析该疾病暴发的主要流行病学特点为：患病珍珠龙胆石斑鱼体色发黑，厌食，死亡率达90%以上，具有一定的季节性。组织病理学实验表明患病鱼体脑组织、神经系统及视网膜组织出现大量的空泡化坏死病变。电镜切片观察到在神经组织中含有大量的20-30nm的病毒颗粒,呈晶格状排列在细胞质中。另外，使用世界动物卫生组织（OIE）推

6、荐的检测NNV的PCR引物，成功的扩增出特异性条带（421bp）。结合该疾病的流行病学，患病鱼体的组织病理学，及分子生物学确诊了导致此次珍珠龙胆石斑鱼鱼苗患病死亡的病原体为NNV。在确定致病病原的基础上，利用四对引物成功的扩增出NNV含有的RNA1和RNA2的基因序列，并上传到GenBank中（获得的登陆号分别为：KF668184、KF668183），利用DNAstar软件分析后表明此RNA1和RNA2的开放阅读框(ORF)分别编码982和338个氨基酸。I上海海洋大学硕士学位论文其基因系统发育树分析表明该分离获取的NNV基因型属于RGN

7、NV型。该基因型为我国内陆常见基因型，为后续的药物筛选提供了典型的病毒来源。2细胞系建立及对NNV的敏感性为了尽可能的排除不同来源病毒株在感染鱼体过程中的宿主特异性，本研究直接利用健康珍珠龙胆石斑鱼的脑组织进行细胞培养，并成功建系暂命名为PB细胞系。通过对PB细胞系生长条件（FBS含量、生长因子）的研究表明该细胞系在含有微量bFGF因子和10%FBS的1.5×L-15细胞培养液中贴壁生长良好。使用一定量的病毒粗提液添加到该细胞系后，虽然没有出现明显的细胞皱缩、变圆、脱落等典型的细胞病变（CPE），但细胞经Hoechst染色后，细胞核出现了

8、一定程度的颗粒浓染现象，表明了病毒对该细胞系有一定的影响，细胞出现了轻微的退性病变，但表现在细胞总体上的CPE，并不明显。后续进行的相对荧光定量结果也表明了NNV在细胞中有一定的增殖。本试验成