鱼类神经坏死病毒流行病学调查、组织病理观察及其衣壳蛋白基因在鸟类细胞中的表达

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1、中山大学博士学位论文鱼类神经坏死病毒流行病学调查、组织病理观察及其衣壳蛋白基因在鸟类细胞中的表达姓名：黄剑南申请学位级别：博士专业：水生生物学指导教师：何建国20041101黄客4南串出太学德士学搜论文攘熏鱼类耱经坏琵病毒流行病学诿查、缀织病理麓察及其袭巍蛋翁基因在鸟类细魏中的表达专业：水生生物学耩士生：獒受毫铎师：何建国教授摘要磊瓣鱼楚撬謦南方耪萤繁眷鹚璃戆葵殖戆蓬要经济蒹耱，瘸毒整穗经豁甄霾(Ⅵ州)的爆发流行给嚣斑鱼游殖造成蓬大损必，因此有必要澍引发该病的神经坏死瘸毒(NNV)避行深入研究。本文采孺半套式秘套式逶转录一聚台酶链式反痤(R墨P

2、CR)，对大驻湾野生积弼籍褡殖海水鱼类、人工繁肖的斜带石斑(Epinepheluscoioides)神经坏死病毒的感染避幸亍季节性调查。共采集剐5匿20辩69释883慰鹭生海承垒，l鞋3辩1l静381遑露籍养猹海水鱼，斜繁石斑受精卵和人工繁赋鱼苗180批。半套式RT-PCR对野生和阀箱养殖海水鱼样品的检溅瑟慕，莰套i5辩努生鱼器8释养臻篷孛裣瓣裂病毒，爨生稻葬整耱蹙茨蘸簿检出率分别为21，7％和72．7％。套式RT-PCR梭测的结浆，38种野生鱼(2003年l露j中育32释梭蠹瘸毒，释粪静病毒稳舞率荛84．2％；9静赛巯垒(2003年

3、、6月)

4、金粼检出瘸毒，种擞的病毒检出率为100％。用半套式RT-PCR方法检测斜带石斑受精卵翮入工繁殖鱼苗样品106戡，斜带石斑鱼卵9抿，7蠢毛样品阳性，闱洼率77。8％；孵{乞磊12,、-42d斜荣石斑惫茁97搬，53批撵品期量塞，翔性攀54。6％。序列测定和系统进化分析表明，所感染的神经坏死病毒均为赤点石斑神经坏死滴毒基嚣型墨GNNW)。缀缮李交鼢调查郓分撬臻基，4蟊】4辩25耱野生海承鱼鞫1月2科3种蒯箱养殖海水鱼为神经环歹E病毒的新宿主。本文对赤点石褒<最akaara)蘸簿控稿羟球殛癌瀚癀嫠学避{亍了磷究。在光学显微镜下，在病鱼的腩部、脊髓、视

5、嘲膜可见明显的空泡，肠的上皮层也观察到空沲，其它器官，搬鳃、心簸、籍j{il!、瞥越、脾藏、胰薤、皮获、瓣两等没商黄翎寿串国大学博士学位论文擒妥惑冤臻显熬空逸。蠲兔藐羧鲣NNV衣轰缀臼盎渔终为第一摭传，遴厅免疫荧光观察，病髯农壳蛋自在脑郝、视网膜和鳃上皮细胞内可以观察到强阳性反应，在j}_{=缁施蠹毪瘸察裂鞲静辩悭反瘟，弱遂上寂静荧壳僖号毙瓣}帮露橇鹾瀵豹弱褥多。地高辛探针原位杂交法观察结槊，炳毒核酸主臻分布诒=脑部、脊髓、视网膜。脊髓部的阳性反应避强，其次为脑部，爵次为褫网膜。在鳃、肠遵上皮绍溅和嚣手细胞中也观察到期性反应。透射电镜下，程脑和

6、视网膜的细胞质中可以观察到25～28nm的病毒粒子。痫毒随机分布在细胞质中或者包在一膜性结构内，排列戒潞撂状。病毒的衣壳鬣白和病毒的宿主特异憔、侵染、流行、成熟、进化等密切相关，因照对病毒农蠢蛋自瓣磺究杰疾痿貔治上县毒霪要意义。枣文慰赤煮露斑耪经坏死病毒大亚湾株(RG-CN)谶行了纯化，测定计算其浮力密度为1．3102～l。32439／cm3。通避Western。blot滚检瓣舞

7、!l擘结梅蛋自靛分子量兔37帮31kDa，而以31kDa的蛋囱为主。分别用l对引物进行RT-PCR扩增，得到RG-CN衣壳蛋白基因的开放阅读框(ORF)翔全长。将PC

8、R产物亮隧舞peDNA3载俸t梅建重组质糖pcDNA3。CP7粒peDNA3．FL3并测序。测序分析表明，RG·CN农壳蠹白基因(RNA2)长度为1435个碱基，只含有一个长度为1017个碱基的ORF，缓鹚338令氮基酸。攫攒孩营酸黟歹l进行分予系绕分折，RG-CN震于赤患石斑神经坏死病毒基因型。成功缝将RG．CN衣巍餐自基强转豢翻鸟类缎貔中表这。将peDNA3-CP7彝DcDNA3，FL3转染到鸡肝肿瘤细胞(LMH)和人子宫颈癌细胞(HeLa)，用免疫荧光和Western—blot法检测蛋白表达，丽辩转染绿色荧光缓自(GFP)矮耱佟舞搬告蛋白

9、。pcDNA3．CP7、pcDNA3．FL3可以在LMH中分别表达出31kDa、40kDa的蛋白．而且都只在LMH细胞中表达，并不分泌到细胞外。憾它们都没有在}{eLa中表达。氮疫荧光检测结果，pcDNA3．FL3在LMH中的表达偿号较DcDNA3．CP7强20多倍。GFP的荧光蛋囱检测结果，两种质粒在LMH和HeLa中豹转染效率是稳嗣豹。i3．骐动蛋是的Western-blot检测表明，LMH秽HeLa都处于健康状态。因此这两种质粒在LMH和HeLa中表迭的差髯与细胞的转染效率醴及缩麓懿穗壕程度无关。由于pcDNA3一CP7中衣蠢蛋自蒸遴豹撬

10、入冀段一{s只有ORF，没有非翻译区，而pcDNA3一FL3中衣壳蛋白基因的插入片段中有5’、黄剑南中山大学博士学位论文摘要3’非翻译区，因此本文推测