番鸭源禽1型副粘病毒p基因克隆与原核表达

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1、福建农林大学硕士学位论文中文摘要禽1型副粘病毒(Avianparamyxovirustypel，APMV一1)是副粘病毒科副粘病毒亚科禽腮腺炎病毒属的成员，是危害养禽业最为严重的传染病病原之一，其代表毒株为新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus，NDV)。其引起的疫病——新城疫被世界动物卫生组织(DIE)列为A类烈性传染病，因此其病原的研究也成为禽病研究的重点和热点。2002年以来，我国浙江、福建等省份部分地区8～40日龄的番鸭发生一种以表现神经症状、呼吸困难、腹泻为主要临床特征的疫病，发病率高达52％，病死率高达30％，经病毒

2、分离鉴定和人工感染试验确定为APMv-1感染。本实验根据GenBank中水禽源禽1型副粘病毒(zjl)P基因序列设计2对引物，运用RT—PCR技术从福建分离的l株番鸭源AP吖一l(FPI／02株)的基因组中扩增出P全基因的cDNA。测序结果表明，P基因全长144Int，包含一个完整的歼放阅读框架，编码395个氨基酸，通过Genebank的Blast比对分析，有40多株病毒P基因序列同源性较高(同源性在80％以上)，其中与PX2／03株、zjl株和SF02株的同源性最高，达97％。同时借助生物学软件及相关在线分析工具对测序完成的P基因进行基于氨基

3、酸序列的生物信息学分析，包括蛋白质理化特性、蛋白质功能域、基序、空J．日J结构等，分析表明P蛋白无信号肽、卷曲螺旋等功能区特征。以测序正确的P基因为模板，用分别含EcoRI、XhoI的一对引物对该目的基因进行亚克隆后插入到pGEx一5x一1原核表达载体中．重组质粒经酶切鉴定和核苷酸序列分析，结果表明所插入的阅读框正确，序列无误，从而成功地构建了pGEX-SX—I／P原核表达载体。将测序正确的重组质粒p(；EX-SX一1／P分别转化E．coliBL21(DE3)宿主菌，IPTG诱导表达，SDS—PAGE电泳结果表明pGEX-5X一1／P在E．co

4、liBL21(DE3)获得了高效表达，在相应位置上(68KD处)可见明显的目的蛋白表达带；重组蛋白主要以可溶性蛋白的形式表达；GST亲和层析纯化收集蛋白，纯化后的蛋白经III福建农林火学硕士学位论文Western—blot和ELISA初步鉴定能与鸭源禽l型副粘病毒P蛋白阳性血清发生特异反应。本试验成功地克隆了FPI／02株番鸭源APMV-1P基因完整片段，并实现了其在原核表达系统中的高效表达。本试验结果为研究番鸭源APMV一1P基因编码的各蛋白对不同宿主的免疫原性及在APMV—l跨种问致病等方面的作用和禽1型副粘病毒基因工程疫苗、新型诊断试剂的

5、研制奠定基础。关键词：番鸭源禽1型副粘病毒；P基因：克隆；生物信息学分析；原核表达福建农林大学硕十学位论文AbstractAvianparamyxovirustype1(APMV-1)isamemberofthegenusRubulavirus，subfamilyParamyxovridae，familyParamyxovridae，intheorderMononegavirales，whichisoneofthemostseriousinfectiousdiseasesofpoultryintheworld．APMV-1commonlyref

6、erredtoasNewcastlediseasevirlls(NDV)．Nowthenewcastledisease(ND)isconsideredasapotentinfectiousdiseasebYtheworldorganizationforanimalhealth．Thereforetheresearchofwhichbecomesmoreandmoresignificance．Since2002，anewinfectiousdiseasehasprevailedinMuscovyduckinFujianandZhejiangpro

7、vincesinChina．The8—40ageswereattackedbythedisease．whichWerecharacterizedwith．obviousnervoussigns，decompensationanddiarrhea．Themorbidityandthemortalitywas30％、52％，respectively,andwhichWfl$identifiedtobecausedbyAPMV01．TowpairsofprimersWeredesignedaccordingtothesequenceofthephos

8、phoprotein(P)geneoftheZJlstrainavianparamyxovirustype1fromGenebank．ThePgene