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1、8上海畜牧兽医通讯2009年第2期型鸭肝炎病毒VP1基因克隆及其原核表达*孔留五康艳梅何逸民李小康潘全会张桂红(华南农业大学兽医学院广东广州510642)摘要根据Genbank中的型鸭肝炎病毒全基因序列设计了扩增型鸭肝炎病毒VP1基因的包含有EcoRV和XhoI酶切位点的引物,用该特异性引物从型鸭肝炎病毒cDNA模板中扩增得到目的基因VP1,以相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体pET32a后构建重组表达载体,经酶切及PCR鉴定筛选出阳性克隆,测序证明目的基因正确插入了表达载体,转化宿主菌
2、Rosseta,用不同浓度的IPTG诱导VP1基因的表达,收集菌液进行SDS-PAGE电泳,Western-blotting分析蛋白免疫原性。结果表明,VP1在大肠杆菌Rosseta中表达量较高,表达产物的分子量约为48ku、并能被型鸭肝炎病毒阳性血清所识别。型鸭肝炎病毒VP1蛋白在大肠杆菌Rosseta中表达产物具有免疫原性。关键词:型鸭病毒性肝炎病毒;VP1基因;诱导表达雏鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒引起的一种急性高度Xhol酶切位点;取鸭胚尿囊液,按Invitrogen公司TRIzol致死性传染病,主要侵害
3、4周龄以内的雏鸭,特别是1周龄LSReagentRNA提取试剂盒的使用说明进行,提取病毒以下的雏鸭最易感染,死亡率较高,是危害养鸭业最为严重RNA,反转录得到cDNA,以cDNA为模板,进行PCR扩增,11%琼脂糖凝胶电泳观察结果。的传染病之一。本病于1949年首次发现于美国的长岛,1953年开始蔓延至世界各地。本病毒属于小RNA病毒科,肠1.3.2重组质粒的构建:回收扩增的DNA片段,与pMD18道病毒属。现认为DHV有个血清型:即、、型,型鸭肝炎-T载体连接后,转化大肠杆菌DH5、经菌液PCR、酶切和病毒(du
4、ckhepatitisvirus1,DHV1)又称古典株(classicalDHV),此测序鉴定正确的重组质粒命名pMD18-VP1,以Xhol、病毒流行甚广,很多国家的流行病例均属此病2。EcoR同时对pMD18-VP1与pET32a空载体双酶切,回收型鸭肝炎病毒属于小核糖核酸病毒科,病毒粒子呈正后连接过夜,转化大肠杆菌Rosseta,经酶切、测序和PCR二十面体结构,其组成为衣壳蛋白和一条由衣壳蛋白包裹的鉴定正确后,命名为pET32a-VP1。长约7.7kb左右的单链正股RNA组成,Ding2、Kim3~5、
5、1.3.3重组菌诱导表达条件的优化及选定:将阳性菌种Tseng6~8等报道型鸭肝炎病毒在遗传进化关系上与副肠pET32a-VP1在含氨苄(Amp100g/ml)的LB液体培养基孤病毒属(Parechovirus)亲缘关系较近。中培养至OD450值达0.5左右时,加入终浓度1.0mmol/LIPTG进行诱导表达,诱导4h后,取菌液留样SDS-PAGE型鸭肝炎病毒结构蛋白VP1位于DHV1基因组的电泳鉴定表达情况。(1)IPTG浓度的优化,诱导时间选定为2103~2816位,VP1全基因由714个核苷酸组成,编码94h。
6、加入终浓度分别为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、238个氨基酸。然而,目前国内外尚未见有关型鸭肝炎1.8mmol/LIPTG进行诱导表达。取不同IPTG浓度诱导表病毒蛋白基因和功能的研究。因此,本研究采用原核高效表达的菌液留样,诱导4h后,SDS-PAGE电泳鉴定表达情达载体pET-32a在大肠杆菌Rosseta中表达了DHV1-R况。(2)诱导时间的优化,诱导IPTG浓度选定为株的VP1蛋白,这为深入研究VP1蛋白的结构与功能奠定了1.0mmol/L。终浓度1.0mmol/LIPTG进行诱导表达,诱基础
7、,也为研制DHV1的新型疫苗与诊断试剂盒奠定了基础。导0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h后,取不同时间表达1材料和方法菌液留样,SDS-PAGE电泳鉴定表达情况。1.1毒株1.3.4重组蛋白免疫印记检测:用型鸭肝炎病毒阳性血菌种、质粒和型鸭病毒性肝炎病毒由华南农业大学兽清,对表达的融合蛋白用蛋白质印迹法检测。经SDS-医学院禽病研究室保存、提供。大肠杆菌DH5,RossetaPAGE电泳分离蛋白后,用电转移仪低温稳压转移2.5h后,(DE3)由本课题组保存;质粒pET-32a(+)、pMDl8-T取下
8、NC膜,以PBST(pH7.4的PBS0.5mlTween-20)冲Vector购自宝生物工程(大连)有限公司。洗后用封闭液(10mlPBST0.5mg脱脂奶粉)封闭过夜。用1.2试剂PBST冲洗后与型鸭肝炎病毒阳性血清37孵育
