Ⅰ型鸭肝炎病毒VP3基因的克隆及原核表达-论文.pdf

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1、中国畜牧兽医2013年第4O卷第1O期生物技术·33·I型鸭肝炎病毒VP3基因的克隆及原核表达李露，程英杰一，李传峰。陈宗艳，孟春春，何后军。刘光清(1．江西农业大学动物科技学院，江西南昌330045；2．中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241；3．甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州730070)摘要：采用RT—PCR方法从I型鸭肝炎病毒ZJ—V株中扩增3基因，运用DNAStar软件对VP3序列与参考序列的同源性进行比对，并进行了遗传进化分析，然后将3基因克隆至原核表达载体pET一32a(4-)，获

2、得重组表达质粒pET—VP3，转化宿主菌E．coliRosetta(DE3)，经1mmol／IIPTG诱导表达后用SDS-PAGE和Westernblotting方法对表达产物进行检测。结果显示，成功克隆了DHV—I3基因，片段大小为7llbp。序列分析结果表明，zJ—V株VP3与其他A型DHV分离株的同源性较高，为95．1～97．7；而与c型DHV分离株的同源性较低，为71．3～72．6；与B型DHV分离株的VP3基因同源性最差，为70．3～70．5。SDS-PAGE和Westernblotting检测

3、结果显示，重组VP3基因在大肠杆菌细胞(DE3)中获得了良好表达，其分子质量约为47ku；与抗I型鸭肝炎病毒ZJ—V株阳性血清发生特异性免疫反应，表明重组VP3蛋白具有良好免疫原性。关键词：I型鸭肝炎病毒；13基因；原核表达；序列分析中图分类号：Q785文献标识码：A文章编号：1671—7236(2013)10—0033—04I型鸭病毒性肝炎是由工型鸭肝炎病毒(duck意义。本试验旨在通过对DHV—IVP3蛋白进行hepatitisvirusI，DHV一工)引起的雏鸭高度致死性原核表达和鉴定，并基于VP3

4、基因的序列比较不同传染病(Sail等，2004)。DHV一工属于小RNA病毒株DHV的同源性和遗传进化分析，为进一步研究科，禽肝病毒属，可分为3种血清型：DHV—A型、VP3蛋白的结构和功能及研制DHV一工的新型疫苗DHV—B型和DHV—C型，其中DHV—A型对应于血和诊断方法奠定基础。清I型，DHV～B型对应于“台湾新型”，DHV—c型1材料与方法对应于“韩国新型”(Tseng等，2007a；Kim等，2006，1．1材料2007；Ding等，2007)。DHV—I基因组为单股正链1．1．1病毒和阳性血

5、清工型鸭肝炎病毒zJ—VRNA，编码2249个氨基酸，只有1个开放阅读框株(GenBank登录号：EF382778)由中国农业科学院(ORF)，形成1个多聚蛋白，经蛋白酶裂解后形成3上海兽医研究所禽病实验室保存。兔抗I型鸭肝炎种衣壳蛋白(VP0、VP3和VP1)和8或9种非结构病毒ZJ—V阳性血清按常规方法制备，由中国农业蛋白(2A1、2A2或2A2+2A3、2B、2C、3A、3B、3C科学院上海兽医研究所禽病实验室保存。和3D)(Tseng等，2007b；Kim等，2006)，其中31．1．2菌株、载体

6、及试剂2×pfuPCRMaster—基因由711个核苷酸组成，编码237个氨基酸。由Mix、E．coliDH5a感受态细胞和E．coliRosetta于DHV一工分子生物学相关研究进展较缓慢，使得(DE3)感受态细胞均购自天根生化科技(北京)有限对该病的诊断和防治还比较落后。现在对DHV一工公司；原核表达载体pET一32a(+)由中国农业科学蛋白的研究主要集中在VP1基因，VP3作为DHV—院上海兽医研究所禽病实验室提供；限制性内切酶I主要结构蛋白之一，且具有多个抗原位点。因此BamHI和Xho工、T4连

7、接酶均购自宝生物工程开展对DHV—IVP3蛋白的相关研究也具有重要(大连)有限公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗购自北京康为世纪公司。收稿日期：2013—01一O61．2方法作者简介：李露(1989-_)，女，江西人，硕士生，研究方向：禽病毒1．2．1引物设计与合成根据I型鸭肝炎病毒分子生物学。通信作者：刘光清。E～mail：liugq@shvri．ac．cnZJ—V株基因组序列，设计VP3基因特异性引物。何后军。E～mail：hehoujun@163．cornVP3F：5一CCGGGATCCG

8、GAAAGAGAAAACCA—基金项目：国家自然科学基金项目(31101848，31270194)；公益CGCA一3；VP3R：5'-CCGCTCGAGCTGATTATT—性农业科研专项(201003012)；“863”计划GGTTGcCATcT一3(下划线部分分别为BamHI(2011AA10A200)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(2012JB06，2012JB13)。和XhoI酶切位点)，预期扩增的目的片段大小