截短型鸭乙型肝炎病毒核心蛋白原核表达、 多克隆抗

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1、截短型鸭乙型肝炎病毒核心蛋白原核表达、多克隆抗【摘要】目的:构建截短型鸭乙型肝炎病毒（DHBV）核心蛋白的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达,制备多克隆抗体。方法:应用基因工程技术将编码截短型DHBV核心蛋白(DHBcAg1～214aa)的基因片段装入原核表达载体pRSETB内,在宿主菌Rosetta(DE3)pLacI内进行诱导表达,运用NiNTA方法纯化目的蛋白。用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并采用酶联免疫吸附实验(ELISA),r)约为28000的目的蛋白,用之免疫BALB/c小鼠获得了高效价的特异性多克隆抗体。结论:获得的重组截短型DHBV核心抗原纯度高,免

2、疫反应性强;获得的多克隆抗体有较高的效价和较好的特异性,为DHBV的检测和研究奠定了实验基础。【关键词】鸭乙型肝炎病毒核心蛋白原核表达载体多克隆抗体鸭乙型肝炎病毒(duckhepatitisBvirus,DHBV)与人乙型肝炎病毒(HBV)同属嗜肝DNA病毒科,被广泛用于研究嗜肝DNA病毒的复制机制、细胞表面病毒受体、病毒清除机制和筛选新的抗病毒药物的动物模型。DHBV主要编码外膜蛋白、核心蛋白和P蛋白,其中核心蛋白(DHBcAg)分子约262个氨基酸,其氨基端有装配核心颗粒,羧基端有结合核酸的功能[1]。最近研究中,Thermet等[2]通过对DHBcAg和HBcAg抗原决定区（AR）

3、的比对,得出DHBcAgAR5与HBcAgAR2相似的结论,并结合文献报道HBcAg按其功能的不同大致可分为装配区(1～144aa)和核酸结合区(145～183/185aa)[3]。本研究中我们将DHBcAg从AR5后的214位氨基酸截取,构建截短型DHBV核心蛋白的原核表达载体并在大肠杆菌中表达,制备多克隆抗体。　　1材料和方法　　1.1材料　　限制性内切酶XhoI、PstI、T4DNA连接酶、LATaq酶、蛋白marker、DL2000购自TaKaRa公司。NiNTASpinColumnkit购自德国Qiagen公司。鼠抗His单克隆抗体（mAb）和HRP标记羊抗鼠IgG为美国

4、SantaCruz公司产品。GeneRulerTM1kbDNALadder购自立陶宛MBI公司。异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG）购自美国Promega公司。in预变性,随后94℃45s,50℃45s,72℃50s,共30个循环,最后72℃延伸10min。扩增相应片段后回收纯化PCR产物用XhoI和PstI进行酶切,然后与同样双酶切的原核表达载体pRSETB回收纯化后,用T4DNA连接酶16℃连接12h,连接产物转化DH5α菌后挑取克隆,用PCR和酶切法鉴定正确后进行测序分析,该重组质粒命名pRSETBDHBc214。此载体在目的片段的N端有6个His,以便于表达后的鉴定与纯化

5、。　　1.2.2重组质粒的诱导表达　　取重组质粒pRSETBDHBc214转化到E.coliRosetta(DE3)pLacI,涂板,挑克隆,经PCR筛选及酶切鉴定正确后将含有重组质粒的E.coliRosetta(DE3)pLacI接种于1mLSOB培养液内(含100μg/L氨苄青霉素35μg/L氯霉素),37℃摇菌12h左右,以1∶50比例接种到10mLSOB培养液内,37℃摇菌4～6h至A600=0.4～0.6时加入IPTG至终浓度为2mol/L,37℃250r/min诱导1～6h。同时取空载体进行同样的转化、诱导。SDSPAGE电泳分析5h蛋白表达量最大。　　1.2.3目的蛋

6、白的纯化(NiNTA法)　　按方法1.2.2,诱导表达250mL菌液,10000r/min(JA25.50转头)4℃离心10min,沉淀按5mL/g湿质量混悬于预冷的新鲜裂解缓冲液中,再按1g/L加入溶菌酶,冰浴30min后超声破菌。溶解物4℃10000g离心20min,收集上清及沉淀。将沉淀用NiNTASpinColumn纯化,操作方法依照NiNTASpinColumnkit说明进行。纯化蛋白-70℃保存。　　1.2.4目的蛋白的浓度及纯度检测　　用Bradford检测法测定目的蛋白浓度。将目的蛋白表达过程中的各个组分进行SDSPAGE电泳,结果进行蛋白条带灰度扫描,并用Qua

7、ntityOne4.6软件进行纯度分析。　　1.2.5目的蛋白in,再100mA稳流2h转印蛋白到硝酸纤维素膜上,PBST漂洗后用100mL/LFBS/PBST4℃封闭过夜。再用PBST漂洗后用50mL/LFBS/PBST稀释的第一抗体（1∶1000稀释的鼠抗HismAb）,37℃震荡孵育1h,PBST漂洗3次,加入50mL/LFBS/PBST稀释的第二抗体（1∶2000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG）,37℃震荡孵育45min,P