hp-prrsv(hun4)截短nsp2蛋白原核表达及其单克隆抗体制备

《hp-prrsv(hun4)截短nsp2蛋白原核表达及其单克隆抗体制备》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、摘要摘要猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)是在1987年在美国首次发现，由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状为特征的传染病。自2006年开始，高致病性猪繁殖与呼吸综合征(Highlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndrome,HP-PRRS)在我国的暴发与流行给养猪业带来了巨大的经济损失。在高致

2、病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,HP-PRRSV)基因组中，Nsp2基因的第1447~1449位和1597~1698位的核苷酸发生了缺失，与我国2005年以前分离的PRRSV相比Nsp2基因的同源性仅为69.9%~86.2%。本研究以HP-PRRSV(HuN4)为研究对象，在克隆并鉴定该病毒Nsp2基因的基础上，进行Nsp2蛋白的原核表达，并制备相应单克隆抗体，为进一步探究HP-PRRSVNsp2蛋白结构及其功能奠定了基础。研究内容主要包括：1PRRSVNs

3、p2基因的克隆及原核表达根据GenBank中以登录的HP-PRRSV(HuN4)全基因组序列，设计合成了1对特异性引物，对PRRSV非结构蛋白Nsp2包含缺失区部分基因片段基因进行了RT-PCR扩增，将回收的目的片段克隆到大肠埃希氏菌表达载体pET-30a(+)中，构建了重组质粒pET-H-Nsp2。将pET-H-Nsp2转化至大肠埃希氏菌表达菌株BL21(DE3)，用IPTG诱导表达，SDS-PAGE结果表明，重组菌可表达分子量约为63.5ku的蛋白。经镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)纯化，获得了高纯度的重组蛋白，Western-blot结果表明，该蛋白与PRRSV阳性血清具

4、有良好免疫反应性。2HP-PRRSV(HuN4株)Nsp2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定本研究利用原核表达的PRRSV(HuN4)非结构蛋白Nsp2作为免疫原，免疫6周龄雌性BALB/c小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术获得3株稳定分泌针对PRRSVNsp2蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1A5、4B3、3C2，经测定它们单抗亚型分别为IgG2b、IgG1和IgG1。轻链均为κ链。3株杂交瘤细胞诱导小鼠产生的腹水效价分别是1:10240、1:10240和1:20480，Westernblot结果显示，这3株单抗均能与Nsp2蛋白发生反应，间接免疫荧光试验表明所得单抗能与PR

5、RSV(HuN4)感染细胞中的Nsp2蛋白特异性结合。本研究为进一步探究PRRSVNsp2蛋白结构及其功能奠定了基础。关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征；Nsp2蛋白；原核表达；单克隆抗体IAbstractExpressionofTruncatedNsp2ofHP-PRRSV（HuN4）inE.coliandPreparationofMonoclonalAntibodiesagainstNsp2AbstractPorcineReproductiveandRespiratorySyndrome(PRRS)characterizedbyseverereproductivedisor

6、dersinsowsandrespiratorydiseasesinyoungpigs,wasfirstrecognizedintheUSin1987.Since2006,highlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(HP-PRRSV)outbreaksandtheprevalenceinourcountryhadbroughtenormouseconomiclosses.Inthehighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(H

7、P-PRRSV)genome,itwasoccurreddeletioninNsp2genewhichwasthefirst1447~1449and1597~1698nucleotide.ThenucleotidehomologiesofNsp2genewas69.9%~86.2%comparedwithPRRSVisolatedfromourcountrybefore2005.Inthisstudy,theNsp2geneofHP-PRRSV(HuN4strain)wascloned,id