人CyclinD1基因克隆与原核表达-论文.pdf

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1、中国医师杂志2014年2月第16卷第2期JoumalofChinesePhysician，February2014，Vo1．16，Nu．·论著·人CyclinD1基因克隆与原核表达谭艳韩晓芳贾海琴白瑞霞【摘要】目的从人肝癌组织中克隆人的CyclinD1基因，并原核表达CyclinD1蛋白。方法从人肝癌组织中提取RNA，逆转录PCR扩增CyelinD1cDNA，PCR产物进行TA克隆和DNA序列分析；阳性TA克隆CyclinD1片段亚克隆入大肠杆菌BL21的表达载体PET32a+，异丙基一p—D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropylp-D一1一thiogalactopyr

2、anoside，IPTG)诱导表达人Cyc—linD1。结果逆转录PCR扩增出约483bp的DNA片段，TA克隆和DNA序列分析显示重组片段是人CyclinD1基因序列，CyclinD1eDNA亚克隆人大肠杆菌中BL21载体NotI和EcoRI位点之间；异丙基一p-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropylp—D·1一thio—galactopyranoside，IPTG)诱导出约36KD的蛋白。结论从人肝癌组织中成功地扩增出人CyclinD1基因，并且在大肠杆菌中BL21得到表达。[关键词]肝肿瘤／遗传学；细胞周期蛋白D1；克隆，分子；基因表达Cloningandpro

3、karyoticexpressionofhumanCyclinD1geneTanYan，HanXiaofang，JiaHaiqin，BaiRuixia．DepartmentofClinicafLaboratory。InnerMongoliaPeople&Hospital，Hohhot01o0l7，inaCorrespondingauthor：HanXiaofang，Email：xiaofangh717@sina．con【Abstract】ObjectiveToobtaintheCyclinD1throughcloningandprokaryoticexpressiono

4、fCyclinD1gene．MethodsThetotalRNAwasextractedfromlivercancertissue．TheCyclinD1eDNAwasobtainedbyreversetranscriptasepolymerasechainreaction(RT—PCR)．TheCyclinD1eDNAwassequenced，andsub-clonedtothePET32a+．TheprokaryoticexpressedwasusedtoobtaintheCyclinD1．ResultsThe483bpCyclinD1eDNAwasobtained

5、．ThesequenceofCyclinD1wascorrected．The36KDCyclinD1wasobtainedbyprokaryoticexpression．ConclusionsTheCyclinD1cDNAwasobtained．CyclinD1WasexpressedinBL21．【Keywords】Liverneoplasms／genetics；CyclinD1；Cloning，molecular；Geneexpression肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，根据最了人CyclinD1基因，并且在大肠杆菌中得到表达，新统计，全世界每年新发肝癌患者约六

6、十万，居恶性为进一步筛选人CyclinD1的配体或阻断剂，以及制肿瘤的第五位。肝癌的发病机制至今仍不明了，且备人CyclinD1的抗体奠定基础。缺乏有效的早期诊断方法和治疗靶点。细胞周期失1材料与方法控地超常运行将导致癌瘤；而其停滞不前则常是细1．1仪器和试剂RTc-100PCR仪(美国MJ生物胞衰老、凋亡的前奏。细胞周期过程包括G、S、公司生产)；TanonGis-1000凝胶成像分析系统(上G：和M期。Cyclin和CDK基因参与细胞周期的启海天能科技公司)；DNAMarker为DL2000；限制性动与进程的调控，CyclinD1蛋白分子量约36KD，内切酶EcoR

7、I、NotI；pMD19-T载体、PET32a+载体、是一种在细胞周期中含量呈周期性变化的细胞周期T4DNA连接酶、RNA提取试剂盒；两步法反转录调节蛋白J，是细胞周期素家族中与细胞周期关系PCR试剂盒均购自大连宝生物公司；琼脂糖凝胶最为密切的成员，是G期重要的周期蛋白，与DNA回收试剂盒购自北京天根公司；质粒提取试剂CDK4的蛋白产物所形成的蛋白激酶复合体，主要盒购自美国Axygen公司；人肝癌组织由本医院病理是参与细胞G，期限制点的调控J，在细胞能否从实验室提供；菌株由内蒙古医科大学惠赠。G期进入s期的过程中发挥关键作用，决定细胞是1