脑缺血再灌注损伤后hif1α对脉络丛细胞的修复作用

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1、中文摘英文摘研究论日U材结附讨结参综述致谢⋯个人简中文摘要脑缺血再灌注损伤后⋯F-1Q对脉络丛细胞的修复作用摘要目的：建立大鼠脑缺血再灌注模型并将体外合成HIF．1a质粒通过颈外．颈内动脉途径注射入大鼠脑组织中，应用透射电子显微镜观察大鼠脉络丛组织在脑缺血再灌注后6h、12h、24h、72h和7d时脉络丛内皮细胞的细胞器及细胞间连接的超微结构改变，以及外源性HIF．1a基因介导的细胞修复情况；探索外源性HIF．1a基因对脑缺血再灌注损伤的保护机制。方法：1外合成的HIF．1a的eDNA，测序后克隆入真核表达载体pcDNA3．1，克隆片段大小：

2、2．5kb；酶切鉴定重组子，根据需要体外扩增。2鼠大脑中动脉脑缺血再灌注模型(MCAO)制作：采用250--280克雄性SD大鼠以10％水合氯醛腹腔麻醉，颈部正中切开，分离暴露颈总动脉分叉部，经颈外动脉向颈内动脉插入线栓，颈外动脉远端丝线结扎，线栓头端距血管分叉处1．8cm，线栓阻塞大脑中动脉。大鼠神经功能缺失评分按ZeaLonga评分标准进行评分，MCAO模型建立2h后，选取ZeaLonga评分为1—4分者为MCAO成功模型，2h后取出线栓并注入HIF．1a质粒，对照组注入PBS。3留取6h、12h、24h、72h和7d脑组织标本观察，将相

3、应时间点实验组与对照组大鼠处死后断头取脑后，视交叉后做2ram厚连续切片，第一片做TTC染色，其余做石蜡包埋，5lam厚连续石蜡切片，行HE染色。4取相同时间点大鼠侧脑室脉络丛组织；低温下迅速取材以4％戊二醛浸泡固定2h(4℃)，用0．1mol／LPBS洗涤，1％锇酸固定2h(室温)，常规梯度乙醇及丙酮逐级脱水，环氧树脂618#包埋。用Reichert--Jung超薄切片机做O．5um厚半薄切片，经1％甲苯胺蓝．天青II染色，光镜下定位制备超薄切片(片厚50nm)。用醋酸双氧铀及枸橼酸铅染色，日立--7500透射电镜观察脑组织的超微形态学改变

4、，了解侧脑室脉络丛的损伤变化情次。。中文摘要5统计学分析：使用SPSS15．0统计软件对实验数据进行统计学分析。组间计量资料比较采用t检验，以P<0．05表示差异有统计学意义。结果：1构建HIF．1acDNA，测序结果与Genebank记载完全一致(GenBankID：3091)，酶切鉴定后获得pcDNA3．1．HIF．1a质粒，克隆片段大小2．5kb。2大鼠神经功能缺失评分按ZeaLonga评分标准进行评分，MCAO模型建立2h后，选取再灌注6h，12h，24h，72h，7d时间点进行观察，实验组与对照组在死亡率上无明显差别，神经功能缺失评

5、分上实验组与对照组无明显差别。3在缺血再灌注早期(6h—24h)实验组与对照组在脑切片TTC染色梗塞面积无明显差别，再灌注72h以后可见实验组梗塞面积小于对照组。4HIF．1a对脑缺血再灌注损伤大鼠脉络丛组织(脏染色)形态学变化的影响：缺血再灌注6h后及12h后，脉络丛组织形态结构尚完整，上皮细胞排列整齐，无明显细胞水肿，细胞间隙大小基本正常，局部可见淋巴细胞浸润，此时治疗组与对照组脉络丛组织大致形态上无明显区别。脉络丛轮廓存在，大体结构完整，’局部可见上皮细胞间隙增宽。缺血再灌注24h后，神经组织病理性改变较前面时间点加重，脉络丛结构松散，

6、细胞间隙扩大，脉络丛上皮细胞高度水肿，部分细胞出现凋亡改变，血管内皮细胞肿胀，部分血管内皮断裂，脉络丛结构完整性破坏，此时间点观察到mF．10【质粒治疗组破坏程度轻于PBS对照组。缺血再灌注72h后，脉络丛上皮细胞凋亡减少，水肿程度未见减轻，与PBS对照组相比HIF．1a质粒治疗组细胞间隙没有进一步增宽，且内皮细胞破坏减少。缺血再灌注7d后，脉络丛组织结构恢复原有轮廓，上皮细胞肿胀程度减轻，部分区域可见纤维增生，为无细胞结构的纤维连接，此时间可以观察到与PBS对照组相比mF．1o【质粒治疗组上皮细胞恢复更完整，血管内皮细胞轮廓更清晰，细胞间隙

7、较之前紧凑。5HIF．1a对大鼠脑缺血再灌注损伤后脉络丛细胞超微结构的影响：PBS对照组与HIF．10【注射组在6h和12h均见内皮细胞水肿，细胞间紧密连接松解，核膜及各种细胞器损伤，少量吞饮小泡；治疗24h后两组间开始出现差异，HIF．1a注射组吞饮小泡数量增加较PBS组明显，且细胞间紧密连接松解相对较少；治疗72h后，HIF．1Q注射组细胞器及吞饮小泡数量2中文摘要明显多于PBS对照组，细胞器水肿现象明显缓解，细胞间紧密连接开始出现明显修复迹象，同HIF．1a注射组相比，PBS对照组细胞间隙较宽，紧密连接恢复不明显，细胞间隙封闭和不如治疗

8、组；治疗7d后，HIF．1a注射组细胞线粒体和粗面内质网等细胞器已恢复正常，整个内皮细胞处于恢复过程中，PBS对照组细胞器恢复不如HIF．1a注射组，尤其以分泌型细