交联β葡萄糖苷酶聚集体的制备与其生产大豆异黄酮活性苷元的研究

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1、交联B．葡萄糖苷酶聚集体的制备及其生产大豆异黄酮活性苷元的研究摘要大豆异黄酮是从大豆中提取的一种植物雌性激素，具有天然抗氧化性、预防癌症、保护心血管和防止骨质疏松等多种生理活性。大豆异黄酮主要以无活性的糖苷形式存在，需经人体肠道中微生物产生的B一葡萄糖苷酶水解为活性苷元才能被吸收进入体内发挥作用，但酶数量有限，导致生物利用度很低。本论文旨在利用无载体固定化技术制备高活性和高稳定性的交联B．葡萄糖苷酶聚集体，为大豆异黄酮活性苷元的生产提供基础。本研究在参考Sheldon小组的研究基础上，以黑瞌霉B．葡萄糖苷酶为研究对象，将游离B一葡萄糖苷酶用硫酸铵沉淀后，以戊二醛作交联剂

2、对其进行化学交联，制备新型的交联B．葡萄糖苷酶聚集体，并对影响交联酶聚集体活性的主要因素进行单因素考察，确定了交联B．葡萄糖苷酶聚集体的制备条件为：聚集条件：0．34U／ml的B．葡萄糖苷酶液在溶液体系pH值为7．0以及冰水浴条件下，经90％饱和度的硫酸铵沉淀30min，可获得比较理想的B．葡萄糖苷酶聚集体。交联条件：B一葡萄糖苷酶聚集体以5％戊二醛水溶液于30℃下交联150min，再经离心、洗涤数次后即得交联B．葡萄糖苷酶聚集体，其酶活回收率可达77．4％。酶学性质研究表明，交联B．葡萄糖苷酶聚集体的最适温度、最适pH值和‰值分别为60℃、pH4．0和4．61x10～

3、mol／L。与游离酶的对照实验表明，交联B．葡萄糖苷酶聚集体显示出了更强的热稳定性、pH稳定性、贮存稳定性和对底物的亲和力。对交联B．葡萄糖苷酶聚集体进行电镜扫描显示，其表面疏水性高且糖基化程度低，结构紧密，颗粒呈球状形式，直径约为800nm左右，每个交联酶聚集体中约包含4x106个8．葡萄糖苷酶分子；对B．葡萄糖苷酶聚集体交联前后的结构进行红外光谱分析表明，交联B．葡萄糖苷酶聚集体中存在较多的由氨基与醛基反应形成的酰胺键，验证了B一葡萄糖苷酶聚集体通过戊二醛的交联作用，形成结构紧密的交联酶聚集体。将制备的交联B．葡萄糖苷酶聚集体用于合成大豆异黄酮活性苷元染料木素，对染

4、料木苷水解转化率约为66％。重复使用10批次后，交联酶聚集体对染料木苷仍能保持35％左右的转化效率，表明其具有良好的使用稳定性。关键词：黑曲霉8．葡萄糖苷酶交联酶聚集体无载体固定化大豆异黄酮PreparationofCross-linkedB-glucosidaseAggregatesandItsApplicationforSoybeanIsoflavoneHydrolyzationABSTRACTSoybeanplaysallimportantroleinthepreventionofdiversechronicdiseases，whichhasattractedgr

5、eatattention．Thesoybean，especiallysoybeanhypocotylisenrichedinhealth·promotingisoflavones，mainlyincludinggenistinanddaidzin．EpidemiologicalstudiesshowedthatindividualswithSO·ybeanisoflavone—richdietshaveevidentlyloweroccurrencesofsomecancersandcoronaryheartdiseasesascomparedtoindividuals

6、withSt；Iybeanisoflavone-lessdiets．AlargenumberofrecentstudieshavepointedtothefactthatSOybearlisoflavoneshavevariousphysiologicalactivities，includingthepreventionofsomecancers，cardiovasculardiseaseandosteoporosis．Thus，theirmarketprospectsareevidentlyattractiveforthenaturalfunctionalhealth

7、foodsthattheefficaciousingredientsaredominantlyisoflavones．Whilethesoybeanisoflavoneglucosideshouldbehydrolyzedintoisoflavoneagluconebeforeshowingitsbio·activities．Inthisresearch，genisteinwasproducedbythe8-glucosidaseimmobilization．Enzymescanbeimmobilizedindifferentways，a