nkg2d配体在不同发育阶段dc的表达及其对nk细胞杀伤活性的影响论文

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1、南方医科大学硕士学位论文NKG2D配体在不同发育阶段DC的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响姓名：涂三芳申请学位级别：硕士专业：内科血液病学指导教师：郭坤元20080410硕士学位论文NKG2D配体在不同发育阶段DC的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响硕士研究生：涂三芳指导导师：郭坤元教授摘要研究背景与目的：自然杀伤细胞(Naturalkillercell，NK细胞)是天然免疫系统的主要效应细胞，对病源感染和转化了的细胞具有自然细胞毒效应。NK细胞表达的受体与靶细胞表面的配体通过遗传模式识别发挥效应。NK细

2、胞杀伤靶细胞受活化性信号和抑制性信号共同调节起作用。其中NKG2D-NKG2D配体为NK细胞主要活化性信号之一，NKG2D配体主要包括包括MHC．I类链相关分子A或B和人巨细胞病毒ULl6蛋白的结合蛋白两大类。’树突状细胞(dendriticcell，DC)是机体免疫系统中最重要的抗原提呈细胞，在获得性免疫应答起着重要的作用。根据发育阶段不同可分为未成熟树突状细胞(immaturedendriticcell，iDC)和成熟树突状细胞(maturedendriticcell，mDC)。它们在形态、表型和功

3、能上均有所不同。近年来研究表明DC与NK细胞在天然免疫早期存在相互作用。一方面DC可增强NK细胞的杀伤的活性，提高NK细胞的数量。另一方面NK细胞可杀伤iDC，同时促进iDC生长成mDC。但到目前为止，NK细胞选择性杀伤iDC的机制未完全明确。此外Rugged等人的研究表明在异基因造血干细胞移植中通过输注HLA．KIR错配的供者NK细胞可提高移植物抗白血病效应效应，同时能降低移植物抗宿主病(Graftversushostdisease，GVHD)。进一步推测同种异体反中文摘要应性自然杀伤(Allo．re

4、activeNaturalKiller,Allo．NK)细胞可能通过杀伤受者DC来降低GVHD效应，但是其是否真能杀伤受者DC，杀伤哪个阶段DC以及杀伤机制未做进一步研究。基于以上理论和研究，本研究的主要目的为通过体外研究来探讨allo--NK细胞是否能杀伤不同阶段DC细胞，以及可能的杀伤机制。本研究以体外诱导培养单核细胞来源的iDC和mDC及磁珠分离异体外周血NK细胞为实验材料，利用RT．PCR和流式细胞术检测iDC和mDC的NKG2D配体的表达，通过阻断allo--NK细胞表面NKG2D受体后检测N

5、K细胞对iDC和mDC的杀伤活性，来探讨①NKG2D配体在iDC和mDC表面表达及差异；(g)allo--NK细胞对不同发育阶段DC的杀伤及差异；③NKG2D-NKG2D配体是否参与allo--NK细胞对不同发育阶段DC的杀伤。实验方法：第一部分：不同发育阶段DC的诱导培养和鉴定1．1不同发育阶段DC的培养方法：分离外周血单个核细胞，培养4h后去除非贴壁细胞，加入rhIL．4、rhGM．CSF培养6天，再加入TNF．Q培养到第9天，倒置显微镜下拍照。l。2扫描电镜对不同发育阶段DC的形态鉴定：收集第6天

6、和第9天的细胞PBS洗涤后，用4％戊二醛固定24h，经过漂洗，脱水，乙酸异物脂置换，干燥，喷金后上机用扫描电镜观察鉴定其形态。1．3流式细胞术对不同发育阶段DC表型的鉴定：收集第6天和第9天的细胞分别加入抗CD80PE、CD86PE．CY5、CDlaFE、CD83FITC单克隆抗体(monoclonalantibody，mAb)，4度标记20min后，PBS洗涤，流式细胞仪(Flowcytometry,FCM)检测其表面的CD80、CD86、CD83、CDla的表达率。第二部分：不同发育阶段DC的NKG

7、2D配体表达的检测2．1iDC和mDC表面NKG2D配体在mRNA水平表达的检测：收集鉴定后的iDC和mDC，RT．PCR法提取RNA，反转录成cDNA，加入硕士学位论文NKG2D五个配体的相应引物进行扩增，检测iDC和mDC的NKG2D五个配体在mRNA水平的表达。2．2iDC和mDC表面NKG2D配体在蛋白水平表达的检测：收集鉴定后的iDC和mDC，分别加入鼠抗人MICA、MICB、ULBPl、ULBP2、ULBP3mAb4度冰箱标记20min后洗涤，再加入FITC标记的兔抗鼠IgG二抗4度标记20

8、min，PBS洗涤后FCM检测iDC和mDC表面NKG2D配体的表达。第三部分：NK细胞对不同发育阶段DC的杀伤3．1NK细胞的分离纯化：分离外周血单个核细胞，加入抗CD56免疫磁珠mAb，按照免疫磁珠分选法分离纯化NK细胞，用FCM检测NK细胞的纯度。3．2NK细胞对不同发育阶段DC的杀伤：收集NK细胞为效应细胞，收集iDC和mDC为靶细胞，按照Cytotox96non-radioactivecytotoxocityassay杀伤试剂盒说