酸预处理对脑缺血的神经保护作用分析

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1、一温州医学院硕二I：学位论文2．4气体80％N2和20％C02混合气，100％C02，95％02和5％C02混合气(脑片孵育用)，95％N2和5％C02混合气(脑片OGD模型用)，80％02和20％C02混合气及100％02为杭州大连光明特种材料部。2．5溶液配制2．5％Trypsin：Trypsin0．25g，溶于10ml解剖液；0．01％多聚赖氨酸：用无菌超纯水配制成100gg／ml，过滤除菌，4℃度储存；人工脑脊液的配制(nACSF)：组成成分(mmol／L)NaCl124KCI5MgS042KH2P041．25NaHC0326CaCl22C6H120610将各组分溶于18Q水中，

2、调PH至7．4小滤器过滤除菌，每管分装500“l，‘一20℃储存，1用时10倍稀释。神经元培养种植液：(compositioninm1)双抗马血清胎牛血清DMEMGlu定容至100ml；神经元培养饲养液：(compositioninm1)101m1．10m1．10ml，78．75m1．250Ill温州医学院硕一L学位论文用；双抗B27NeurobasalGlu定容至100ml；lmI2n11，96．75m1．250“l0．25％TTC溶液配制：秤取0．259T1、C，溶于100ml生理盐水；免疫印迹试剂配制：30％储备胶溶液：丙烯酰胺(Acr)29．0g．亚甲双丙烯酰胺(Bis)1．0g

3、混匀后加ddH20，37。C溶解，定容至100ml，棕色瓶室温保存；30％储备胶溶液：(compositioning)丙烯酰胺(Acr)29．0g；亚甲双丙烯酰胺(Bis)1．0g，混匀后加ddH20，37。C溶解，定容_至100ml，棕色瓶室温保存；lO％SDSo电泳级SDS10．0g加ddH20，68V助溶，浓盐酸调节pH7．2，定容至100ml；10％过硫酸铵(APS)：O．1gAPS加ddH20溶解，定容至1ml，4℃保存，新鲜配制，一周内使TEMED：注意室温较低时TEMED量可加倍，最后灌胶之前再用；11温州i医学院硕一Ij学位论文4分离胶缓冲液(1．5mol／L"Iris·

4、HCl；pH8．8)Tris18．179，ddH20溶解，浓盐酸调节pH8．8，定容至100ml；4浓缩胶缓冲液(O．5mol／LTris·HCI；pH6．8)Tris6．06g，ddH20溶解，浓盐酸调节pH6．8，定容至100ml：5电泳缓冲液(pH8．3)：fcomposition)：Tris16g甘氨酸100gddH20974mlSDS5．3g；七在974mlddH20中加入Tris碱，待溶解完全后，再加甘氨酸，最后加SDS；5膜转移缓冲液(Transferbuffer)：(composition)，Tris15．1g甘氨酸72gSDS2．5g用时取200ml加甲醇200ml，加

5、水至1L；4X加样缓冲液：O．5‘mol／LTris·HCl(pH6．8)2ml10％SDS4mlB一巯基乙醇1m1甘油2mll％溴芬蓝1ml置4。C避光保存。10％SDS：(compositioninm1)，p-巯基乙醇：1，甘油：2，1％溴芬蓝：l，置4℃避光保存；12温州医学院硕士学位论文————————————————————————————————————————————————一————————————————————一漂洗液(PBS—T)：含0．1％Tween一20雕JPBS溶液，6}1LPBS溶液中加1mlTween．20：0．01mol／LPBS(pH7．4)：(com

6、positioning)；NaCl8．0gKCl0．2gNa2HP041．44gKH2P040．24g加ddH20定容至1L封闭液：l×PBST中加入5％脱脂奶粉30ml1．5g4％多聚甲醛：fcomposition)，多聚甲醛40gKH2P04’2H2027．29NaOH6gddH201LpH7．4现配现用。13温州医学院硕士学位论文3实验方法3．1小鼠双侧颈总结扎缺血再灌模型的制作及酸预处理的方法模型制作：参照小鼠双侧颈总动脉结扎缺血再灌模型实验方法¨引，具体制作方法如下：将小鼠仰卧固定，取颈前正中切口，小心分离右侧颈总动脉。用4／0缝合丝线结扎颈总动脉近一已-端。缺血60min后，

7、将缝合线松开，结扎切口，缝合皮肤。假手术组小鼠按相同方法手术，但：不做血管结扎。实验过程中利用恒温毯保持肛温374-0．5℃。手术后将小鼠放入35℃保温孵育箱内至苏醒，苏醒后放入笼中饲养。酸预处理方法：小鼠麻醉后，用面气罩使其吸入20％CO，5min，再吸入正常大气10min，如此循环3次(Fig．1C)，立即给予手术。3．2被动回避检测(passiveavoidancetask)手术后七天，按照文献报道【3¨，小鼠通过穿梭箱来检测