甜瓜谷氨酰胺合成酶基因的克隆及其表达分析研究

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1、硕士学位论文甜瓜谷氨酰胺合成酶基因的克隆及其表达分析研究摘要植物对氮素的吸收利用能力是植物生长发育重要的限制因素之一。谷氨酰胺合成酶（GS）在高等植物氮代谢中起着重要的作用。植物谷氨酰胺合成酶具有多种同工酶，根据亚细胞定位，分为胞液型谷氨酰胺合成酶（GS1）和质体型谷氨酰胺合成酶（GS2）。本研究从网纹甜瓜中克隆了一个质体型谷氨酰胺合成酶的基因并且研究了该基因的表达模式。甜瓜（CucumismeloL.）是世界十大果品之一，是我国重要的一种设施栽培作物。我们利用RACE-PCR方法在甜瓜叶片中克隆了一个谷氨酰

2、胺合成酶基因M-GS2(Melon-GlutamineSynthetaseGene,GenBankaccessionnumber:AY773090)，并利用生物信息学手段对其主要结构特征和功能特征进行了分析。该基因全长1807bp，包括170bp的5’非翻译区（UTR，untranslatedregion）和341bp的3’非翻译区。此序列含有一个1296bp的开放阅读框（ORF，openreadingframe），编码一个432个氨基酸残基的多肽，推测的多肽分子量大小为477kDa，PI=8.06。经生物信

3、息学分析这个多肽是谷氨酰胺合成酶的前体，在这个多肽的N-端有一个53个氨基酸残基的穿越肽段，这个多肽定位于叶绿体内。氨基酸序列和结构分析显示M-GS2编码的这个蛋白包含了一个GSbeta-Grasp功能区和GS催化功能区，这些功能区在植物的谷氨酰胺合成酶中是保守的。进化树分析表明M-GS2和黑核桃（Juglansnigra.）GS2最相近。在研究不同组织中表达模式的分析中表明M-GS2优先在叶中表达，在茎、花和果实中表达较少，而在根中几乎不表达。我们进一步研究了网纹甜瓜质体型谷氨酰胺合成酶（M-GS2）的表达

4、I硕士学位论文模式。试验通过对甜瓜不同处理，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对甜瓜质体型谷氨酰胺合成酶（M-GS2）基因进行mRNA的表达检测，首先分别提取甜瓜幼嫩的根、茎、叶、花和果实组织的总RNA，利用半定量RT-PCR的方法研究了甜瓜M-GS2基因的组织特异性表达。结果表明M-GS2基因优先在叶中表达。其次研究了在不同生理条件下M-GS2基因的表达模式，结果显示在硝态氮处理下，随着氮浓度的增加，M-GS2基因的表达量增高，但是随着处理时间的延长而降低。在铵态氮处理下，处理初期M-GS2基因的表达量

5、随着氮浓度的增大而降低，而后随着氮浓度的增加而升高。结果表明，M-GS2基因的表达水平随着氮素浓度的提高而升高，升高的比例因氮源形态以及处理时间有所不同。不同氮形态比例的氮源对M-GS2基因表达的影响无明显的规律。总体来看，混合态氮有利于甜瓜的生长发育，单一种类的氮肥作用较差，而单一硝态氮则较单一铵态氮好。在不同钾离子浓度处理下，4小时时，M-GS2在12mM时表达量较高，处理一天时，M-GS2的表达量各浓度间变化不大；处理3天时，M-GS2的表达量没有大的差异。在不同浓度的NaCl溶液处理时，在24小时时，

6、M-GS2表达量差异不大；在48小时时，M-GS2的表达量随处理浓度的增加而减少。在甜瓜果实不同发育阶段，M-GS2在3-4周时表达量较大，随着发育时间的增加而减弱。关键词：谷氨酰胺合成酶，基因克隆，甜瓜，生物信息学分析，表达模式分析II硕士学位论文CLONINGANDEXPRESSIONANALYSISOFGLUTAMINESYNTHETASEGENEFROMMELONABSTRACTNitrogenavailabilityisacommonlimitingfactorforplantgrowthandde

7、velopment.Glutaminesynthetase(GS)playsacentralroleinnitrogenmetabolisminallplants.PlantGSoccursasanumberofisoenzymeformsandtheseGSisoformsarelocatedeitherinthecytosol(GS1)orplastid(GS2).Wereportthefirstcloningofanewplastid-locatedglutaminesynthetase(GS)gene

8、M-GS2(GenBankaccessionnumber:AY773090)frommelon(Cucumismelo.L).ThecDNAofM-GS2wasisolatedencodingaGS2precursorpolypeptideof432aminoacidscomposinganN-terminaltransitpeptideof53aminoacidsandlocatedinchlor