梅花鹿s100a4基因的克隆及原核表达

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1、梅花鹿S100A4基因的克隆及原核表达张英，李莉，郝林琳，刘松财，于浩作者简介：张英（1979－），女，实验师，主要从事动物生物化学与分子生物学研究，E-mail:zhangying636@126.com通讯作者：于浩（1977－），男，副教授，E-mail:yuhao1977@sohu.com吉林大学畜牧兽医学院　吉林长春　130062（第一作者联系电话：13504429639,单位名称：吉林大学畜牧兽医学院详细通讯地址：吉林省长春市绿园区西安大路5333号畜牧兽医学院电子邮箱：zhangying636@126.com）(通讯作者联系电话:043

2、1-87836176,单位名称：吉林大学畜牧兽医学院详细通讯地址：吉林省长春市绿园区西安大路5333号畜牧兽医学院电子邮箱：yuhao1977@sohu.com）摘要：目的为确定梅花鹿S100A4蛋白在鹿茸发生中的作用机制，大量制备并获得纯化的S100A4蛋白。方法本研究从梅花鹿锯茸血细胞中提取总RNA并进行反转录，用设计的特异性扩增梅花鹿的S100A4基因，将PCR产物克隆到pMD18-T载体并测序。而后将扩增的梅花鹿S100A4基因片段和原核表达质粒pET-28a(+)分别用EcoRI和HindⅢ进行双酶切并连接，再将重组质粒转入BL21（DE

3、3）表达菌株进行诱导表达。结果S100A4基因序列同源性分析结果显示，梅花鹿S100A4基因与牛S100A4基因同源性最高（98.4%）。酶切鉴定结果显示，本研究成功构建了表达梅花鹿S100A4基因的重组质粒pET28a-S100A4，SDS-PAGE电泳结果表明S100A4蛋白获得成功表达。结论在大肠杆菌中成功表达了梅花鹿S100A4基因，为下一步研究S100A4蛋白在鹿茸生长过程中的作用机制奠定了基础。关键词：梅花鹿；S100A4基因；克隆；表达CloningandProkaryoticExpressionofS100A4ProteinofSi

4、kaDeerZhangYing,LiLi,HaoLin-lin,LiuSong-cai,YuHaoCollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,JilinUniversity,Changchun130062Abstract:ObjectiveInordertounderstandtheregulatorymechanismofS100calciumbindingproteinA4(S100A4)inantlergenerationofsikadeer.MethodsweclonedS100A4genefro

5、mtotalRNAofSikadeer’santlerbloodusingreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR).AndthenpET-28a(+)plasmidsandS100A4fragmentweredigestedwithrestrictionenzymesEcoRIandHindⅢrespectively,andthenlinkedtogethertoconstructtherecombinantexpressingplasmidspET28a-S100A4.Andthere

6、combinantplasmidsweretransformedintocompetentBL21(DE3)cells,andexpressionofproteinwasinducedbytheIPTG.ResultsThesequenceanalysisshowedthattheS100A4nucleotideidentitywas85.6%～98.4%amongSikadeerandotherfiveanimals(sharehighesthomologywithCattle).SDS-PAGEresultsshowedthattheS100A

7、4proteinwassuccessfullyexpressedinE.Coli..ConclusionsThisexperimentsuccessfullyproducedSika’sS100A4moleculebyprokaryoticexpressionsystem,whichbuildthefoundationfortheresearchontheregulatorymechanismofS100A4inantlergeneration.Keywords:SikaDeer,S100A4,Cloning,ExpressionS100蛋白家族是

8、一类应用广泛的钙调节蛋白，主要参与细胞分化、细胞周期活动以及细胞外基质的分泌活动等。S100A4蛋白属于S100蛋白家族，