梅花鹿vegf基因的克隆、原核表达及对细胞增殖的影响

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1、分类号：Q71单位代码：10193密级：无学号：2012220硕士学位论文梅花鹿VEGF基因的克隆、原核表达及对细胞增殖的影响StudyonCloningExpressionandBiologicalActivityofVEGFGenefromSikaDeer作者姓名：吴炎学位类别：理学硕士专业名称：生物化学与分子生物学研究方向：生物大分子的结构与功能研究指导教师：胡薇副教授所在学院：生命科学学院2015年5月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。

2、尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大

3、学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日摘要

4、鹿茸是雄性梅花鹿或马鹿的带有红黄色或棕黄色细茸毛未长成硬骨时的嫩角，也是哺乳动物中唯一能够完全再生的器官。人们逐渐发现鹿茸具有特殊的分子机理，有很高的研究价值。随着研究深入，鹿茸细胞生长因子已经被认为是调节鹿茸再生发育的主效因子之一。近年，细胞生长因子的研究已经成为热点，其中血管内皮生长因子（VEGF）已经被证实存在于鹿茸顶端组织中。在鹿茸组织的快速生长中，血管的分布也越来越旺盛。血管内皮生长因子是一种促生长和修复蛋白，特异性地作用于血管内皮细胞，促进其增殖，提高血管的通透性，改善血液循环，在鹿

5、茸血管生成和发育过程中起着重要的调节作用。因此，本研究将对梅花鹿VEGF基因的功能进行初步研究，为深入探讨梅花鹿VEGF基因对鹿茸生长的调节机制提供理论依据，也为鹿茸细胞因子在再生医学和肿瘤医学的快速发展提供参考依据。本实验利用PCR技术获得梅花鹿VEGF基因，纯化回收目的片段，并插入到pMD-18T载体中，转化进入宿主菌大肠杆菌DH5ɑ中挑选出阳性菌对其进行PCR反应和双酶切反应鉴定，并进行测序。采用免疫组化法检测鹿茸VEGF蛋白在鹿茸顶端组织茸皮层、间充质层和软骨层的表达水平。再构建原核表达

6、载体pET-30a-VEGF，转化大肠杆菌Rosetta宿主菌中，筛选高效率转化子，并摇瓶培养，经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳检测，经镍离子亲和层析柱纯化目的蛋白，并进行目的蛋白复性，经Westernblotting检测重组蛋白VEGF抗原活性，最后利用MTT法检测重组蛋白VEGF对鼠成纤维细胞NIH3T3增殖的影响。实验结果表明，克隆获得VEGF基因序列，长度为519bp，与牛、羊、猪的核苷酸序列的同源性分别为98.78%、97.56%、96.95%，与牛、羊、猪的氨基酸序列同源性分

7、别为98.79%、97.78%、96.36%。免疫组化结果表明VEGF蛋白在茸皮层、间充质层和软骨层中均有表达，但是没有明显差异。Westernblotting结果表明，鹿茸VEGF重组蛋白具抗原活性，MTT实验表明VEGF重组蛋白对鼠成纤维NIH3T3细胞具有一定的增殖作用。关键词：梅花鹿，鹿茸，血管内皮生长因子，克隆，原核表达，细胞增殖IAbstractDeerantleristhemalesikadeerorreddeerwithdenselyhairy.Thetenderangledee

8、rantlerdidnotgrowintohardangle.Deerantlerisalsotheonlyorgancanbecompletelyregeneratedinmammals.Peoplegraduallydiscoveredthatdeerantlerhadnalwaysbeentheavaluabletraditionalmedicineandhadhighmedicinalvalue.Withthedeeperstudy,deerantlercellgrowthfactorh