e2-2基因腺病毒载体的构建及其对epcs生长,增殖及id1表达的影响

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1、E2-2基因腺病毒载体的构建及其对EPCs生长、增殖及ID1表达的影响刘晓丽，杨海捷，谭志胜，苏勇，朱琴，王红(650032昆明，成都军区昆明总医院干部病房)[摘要]目的构建转录因子E2-2基因腺病毒载体，并观测内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells,EPCs）过表达E2-2基因对DNA结合抑制因子-1（inhibitorofDNAbinding/differentiation,ID1）表达的影响。方法　分离、培养并鉴定小鼠骨髓EPCs。RT-PCR法扩增E2-2基因CDs全长DNA，克隆入载体pTG19-T后，亚克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中，构建p

2、AdTrack/E2-2重组载体,与pAdEasy-1骨架质粒同源重组形成重组病毒pAd/E2-2，经293细胞包装，获具高效感染力的重组pAd/E2-2病毒。将该病毒感染EPCs，倒置显微镜观测经感染的EPCs的GFP表达情况。CCK-8（cellcountkit-8)）法检测病毒pAd/E2-2对EPCs生长、增殖的影响。RT-PCR、Westernblot分别检测经感染的EPCs中E2-2与ID1基因及其编码蛋白的表达情况，并予以定量分析。结果分离、培养并鉴定到小鼠骨髓EPCs。克隆到2013bp的E2-2基因，并获得高效感染力的重组pAd/E2-2病毒。CCK-8法检测表明，与对照比较

3、，过表达E2-2的EPCs的生长、增殖速度减慢，48h开始变得尤为明显（P<0.01）；RT-PCR、Westernblot及定量分析结果显示，E2-2能下调ID1的表达，与对照比较，差异具统计学意义(p<0.01)。结论分离、培养并鉴定到小鼠骨髓EPCs。克隆到E2-2基因，证实了E2-2能明显抑制EPCs的生长、增殖，并能下调ID1基因的表达。[关键词]EPCs；E2-2基因；ID1基因；腺病毒[中图法分类号][文献标志码]AConstructionofadenovirusvectorofE2-2geneanditseffectsontheexpressionofID1geneLiuXia

4、oli,YangHaijie,TanZhisheng,SuYong,ZhuQin,WangHong(militaryunitscadresinKunmingGeneralHospitalofchengdumilitaryregion，Kunming650032)[Abstract]ObjectiveToconstructtheadenovirusvectorofE2-2geneandinvestigatewhethertheadenovirusvectorcarryingE2-2geneaffectingtheexpressionofID1geneinendothelialprogenitor

5、cells（EPCs）.MethodsMurineEPCsofbonemarrowshouldbeisolated,culturedandidentified.cDNAfragmentencodingmurineE2-2genewasamplifiedbyreversetranscriptase-polymerasechainreaction(RT-PCR).ThePCRamplifiedfragmentofE2-2genewasfirstclonedintopTG19-Tvector,andthensubclonedE2-2geneintotheshuttlevectorpAdTrack-C

6、MVforconstructingtherecombinantplasmidspAdTrack/E2-2,whichhomologouslyrecombinatedwiththeadenoviralbackbonevectorsAdeasy-1togeneraterecombinantadenoviralplasmidsAd/E2-2.TherecombinantadenovirusesAd/E2-2,whichwereemployedtoinfectEPCs,weregeneratedbytransfectingtherecombinantadenoviralDNAinto293cells.

7、Theexpressionofenhancedgreenfluorescentprotein(EGFP)intransfectedEPCswereobservedunderinvertmicroscope.ThegrowthandproliferationoftransfectedEPCsweretestedviaCellcountkit-8(CCK-8),andtheexpreesionofE2