gpershrna表达载体的构建及其对血管内皮细胞增殖影响

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1、摘要＼IYlllllllll／lll／19llllll5ll／llt71111t9llllll6lllllll6llIY1957966目的：构建人和小鼠共用的G蛋白偶联雌激素受体(G-protein-coupledreceptor30，GPER)短发夹RNA(shorthairpinRNA，sl州A)真核表达质粒，鉴定其对人血管内皮细胞(Humanvascularendothelialcells，HⅥ!Cs)和小鼠血管内皮细胞(mousevascularendothelialcells，MVECs)GPER表达的影响，并观察其对人与小鼠血管内皮细胞增殖的影响。方法：设计并体外合成靶向(人和小

2、鼠)基因GPER的特异性编码短发卡RNA(shorthairRNA，shRNA)序列的寡核苷酸，同时合成一对错义的非特异性序列作为阴性对照，退火，连接到经限制性核酸内切酶BglII、HindlII酶切处理的线性化pSUPER质粒中，转化感受态大肠杆菌，挑取阳性克隆，抽提重组质粒，进行EcoRI、HindlII双酶切电泳及测序鉴定，构建shRNA重组质粒；培养人与小鼠的血管内皮细胞(vascularendothelialcells，ECs)，进而将构建的三组重组质粒用脂质体法分别转染人和小鼠的血管内皮细胞，蛋白质印迹(Westernb100检测各组GPER蛋白水平的表达，用M兀法检测构建重组质

3、粒对人血管内皮细胞及小鼠血管内皮细胞增殖的影响。结果：GPERshRNA重组质粒经酶切及测序分析表明：目的核苷酸序列成功插入了预计位点且序列完全一致；转染了GPERshRNA质粒的人血管内皮细胞和小鼠血管内皮细胞，与对照组相比均可下调GPER蛋白的表达(P

4、建的重组质粒转染人与小鼠血管内皮细胞，可显著抑制人与小鼠血管ECs的增殖，为II摘要后期的多项研究奠定基础，提供重要的工具a关键词：G蛋白偶联雌激素受体；ILNA干扰；血管内皮细胞IIIAbstractABSTRACTobjective：ToobservetheeffectofGPERonHVECsandMVECsproliferation，shorthairpinRNA(shI州A)eukaryoticexpressionplasmidofhumanandmouseG-protein—coupledreceptor30(GPER)wasconstructed，andidentifiedit

5、seffectsonGPERexpressioninHVECsandMVECs．Methods：．TwodifferentshRNAoligonucleotidestargetingthecodingsequenceofhumanGPERmRNAandmouseGPERmRNAweredesignedandsynthesizedinvitro，whileamissensenon—specificsequenceWassynthesizedasnegativecontrol，then，theywereannealedandconnectedintothepSuperplasmidswhicht

6、heywerelinearizedbyBglII-HindIII．GPERshRNAexpressionplasmidsweretransformedintoE．Coli．Positivecloneswerepicked．PlasmidswereextractedandidentifiedbytheEcoRI，HindIIIrestrictionenzymedigestionandsequenceanalysis．HVECsandMVECswerecultured．thentherecombinantplasmidsweretransfectedintoHVECsandMVECsviaLip

7、ofectamine2000．ExpressionofGPERproteinwasdetectedbyWesternblot．AftertherecombinantplasmidWaStmnsfectedintoHVECsandMVECs，proliferationofHVECsandMVECsweredetectedbyMTT．Results：GPERshRNAexpressionplasmidsweres