《cr技术相关知识》word版

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1、一步法和两步法RT-PCR的根本区别？答：有中间产物cDNA，但稍微麻烦一点；一步法简单，但得不到cDNA。两步法一步法同两步法RT-PCR的比较:两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测多个mRNA时比较有用。然而一步法RT-PCR具有其他优点。一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖。一步法可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，这是因为整个cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法RT-PCR，一般使用反义的基因特异性引物起始c

2、DNA合成。2．10增加RT-PCR特异性第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5'末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的cD

3、NA主要是核糖体RNA，所以模板一般选用poly(A)+RNA。Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA3'端所发现的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2％，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用0.5μgoligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。ThermoScriptRT-PC

4、RSystem提供了oligo(dT)20，因为其热稳定性较好，适用于较高的保温温度。基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dT)那样同所有RNA退火。用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。GSP可以同与mRNA3'最末端退火的扩增引物序列相同，或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。对于部分扩增对象，为了成功进行RT-PCR，需要设计多于一个反义引物，因为目的RNA的二级结构可能会阻止引

5、物结合。建议在20μl的第一链合成反应体系中使用1pmol反义GSP。RT-PCR实验步骤：一、组织抽提：1.取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末2.移入玻璃匀浆器加入1mlTrizol抽打匀浆3.移入1.5ml新离心管用5ml针头抽打4.冰上孵育5分钟5.离心12,000g4℃5分钟取上清液移入1.5ml新离心管6.加0.2ml氯仿，震荡，冰上孵育5分钟7.离心<12,000g4℃10分钟取上层液相移入1.5ml新离心管8.加0.5ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟9.离心<12,000g4℃5分钟弃去上

6、清液10.加入1ml75%乙醇，震荡11.离心<7,500g4℃5分钟弃去上清液12.室温下使之变透明13.加入DEPC处理水10μl--35μl溶解RNA（可保存在液氮或低温冰箱）14.走RNA变性电泳观察18s，28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值，计算RNA浓度二、RT反应体系（第一步）：约20分钟RNA抽提物5μlRadome引物2μlRNAsin0.5μl1.65℃15分钟2.立即放入冰浴RT反应体系（第二步）：约2小时RNAsin0.5μl10mMdNTP1μl5×RT缓冲液4μl25mM

7、MgCl24μlAMV逆转录酶3μl1.37℃1.5小时2.94℃5-10分钟3.反应物保存于-20℃或进行PCR三1、PCR反应体系：约4.5小时25mMMgCl22μl10×PCR缓冲液5μl10mMdNTP1μl上下游引物10pmol/μl2.5μl×2CDNA模板2.5μlddH2O34μlTaq酶0.5μl轻质石蜡油50μl100μl1.94℃2分钟，55℃1分钟，72℃2分钟为第一个步1个循环2.94℃45秒，55℃40秒，72℃1分钟为第二步30个循环3.72℃10分钟4.取出后4℃5分钟后-20℃保

8、存或走电泳三2、PCR反应体系：约5小时25mMMgCl23μl10×PCR缓冲液5μl10mMdNTP1μl上下游引物10pmol/μl2.5μl×2CDNA模板5μlddH2O30μlTaq酶1μl轻质石蜡油50μl100μl1.94℃2分钟，55℃1分钟，72℃2分钟为第一个步1个循环2.94℃45秒，50℃40秒，72℃1分钟为第二步40个循环3.7