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时间:2019-07-01
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1、一、聚合酶链式反应(PCR)聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR):是一种体外酶促扩增特定DNA片段的技术,即将微量的DNA进行成倍扩增。7/23/20211(一)原理:建立在DNA复制原理基础上的一种技术。7/23/202127/23/20213(二)典型的PCR包括许多循环,每个循环包括三个步骤:(1)高温变性模板使之成为单链,95度约1min;(2)低温使引物与单链模板退火(复性)55度左右;(3)中温使引物沿模板延伸,75度左右。经n次(25-30次)循环后,反应混合物中所含
2、目的DNA片段(双链)的拷贝数理论上最高值为2n。但是,在第三轮循环后,才会出现目的DNA片段。7/23/202147/23/20215思考题扩增片断的长度的是如何决定的?若以N表示扩增循环数,当一条双链模板循环扩增30次时,反应体系中总分子数多少?非目的产物多少?目的产物多少?若用一条引物能否实现大量扩增?7/23/20216(三)PCR反应体系:反应缓冲液(10×PCRBuffer)脱氧核苷三磷酸底物(dNTPmix)耐热DNA聚合酶(Taq酶,可耐受95度左右高温)寡聚核苷酸引物(Primer1,Primer2
3、,约20个核苷酸,与目的DNA两侧的区域互补)靶序列(DNA模板)五部分组成。7/23/202177/23/202181.耐热DNA聚合酶TaqDNA聚合酶的特点TaqDNA聚合酶是从一种极度嗜热水生栖热菌YT-1中分离纯化而得。1)具有5’-3’聚合酶活性和5’-3’核酸外切酶活性2)最适反应温度为80℃3)最适pH8.0和最佳反缓冲液Tris·HCl4)最佳二价阳离子Mg2+,其浓度取决于dNTP浓度(2mM)5)具良好的热稳定性:在90℃下连续反应30分钟仍有约50%的酶活核苷酸错误掺入的几率比较高7/23/2
4、0219TaqDNA聚合酶的特性7/23/202110TthDNA聚合酶的特点:从喜温性真菌中分离获得1)具有强的5’-3’聚合酶活性,缺3’-5’核酸外切酶活性。2)反应pH值为9,最适温度为75度。3)在Mn2+存在时,具有很强的反转录酶活性。4)当系统同时存在Mg2+时,反转录产生的cDNA在这种酶的作用下还可以进行PCR扩增。故可用于RT-PCR。7/23/202111PwoDNA聚合酶从喜温性古细菌中发现,现在市场销售的PwoDNA聚合酶是在E.coli中表达后提取的产物。1)具有强的5’-3’聚合酶活性,
5、兼有3’-5’外切酶活性。2)具有高的耐热性,100度下2小时后仍有一半的活性。3)可扩增5kb的片段,扩增DNA的准确度比TaqDNA聚合酶高约10倍。4)且其扩增产物为平末端,可直接用于平末端连接。C.therm.聚合酶1)是一种以Mg2+为辅助因子的逆转录酶,最适温度在60-70度之间。在RT-PCR系统中催化逆转录反应。2)具有3’-5’外切酶活性,合成cDNA准确度比TthDNA聚合酶高约2倍。7/23/2021122.模板:PCR扩增的模板通常是从细胞中提取出来的总DNA,也可以是mRNA反转录后形成的c
6、DNA。DNA是一种非常稳定的分子,其作为模板影响PCR效果的因素有:1.模板的纯度;2.模板DNA的量;7/23/2021133.PCR引物:PCR引物是与模板DNA互补的两条人工合成的寡核苷酸链,通常由15-30个核苷酸构成。引物与单链DNA模板的3’端互补且具有游离的3’羟基。引物互补于所需扩增DNA片段的两端,使DNA片段的扩增只限于引物之间的区段。3’5’5’3’-OHHO-7/23/202114引物的设计:1.引物长度:一般20bp左右。2.引物的碱基组成:一般G+C占50-60%,尽量避免数个连续排列的
7、嘌呤或嘧啶。一对引物之间不能有2个以上的碱基互补,特别是3’端;引物本身避免有回文序列。3.酶切位点的设计:PCR扩增中,对引物5’端碱基的要求较低,可在引物的5’端加上特殊序列,如限制性酶切位点。4.复性的温度:引物与模板复性温度和所需时间取决于引物的碱基组成、长度、溶液中引物的浓度。复性温度一般低于引物本身的实际变性温度(Tm)5度。Tm=(G+C)X4+(A+T)X2。复性温度通常在55-72度之间,提高复性温度可提高引物与模板结合的特异性。7/23/2021154.dNTPs:是dATP、dCTP、dGTP、
8、dTTP的总称,储存液pH7.0,浓度一般为2mM,分装后-20度冻存。典型的PCR扩增体系中,dNTPs的终浓度为20-200uM。5.Mg2+浓度:Mg2+浓度太低会无PCR产物,太高会导致非特异产物的合成。通常情况下,反应体系中有0.5-2.5mM游离Mg2+。6.PCR系统中的其他成分:PCR反应缓冲液通常用10mMTris-HCl(p
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