《CR及SSCPPAGE技术》PPT课件

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1、PCR技术课程安排PCR扩增：人HLA-DRB基因（基因组DNA为模板）人β-actin基因（cDNA为模板）PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析（β-actin）PCR产物的SSCP－PAGE分析（HLA-DRB）PCR基本原理及相关知识概念聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）是一种体外扩增特异DNA片断的技术,能在短时间内获得数百万个特异DNA序列的拷贝。KaryMullisPCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室KaryMullis及同事于1985年发现并研制成功的。KaryMulli

2、s因发明了“聚合酶链式反应”而获得1993年度诺贝尔化学奖。相对DNA克隆而言，这种方法的特点：操作简便、时间短、特异性高、灵敏度高、实用性强；广泛的应用于医学诊断、分子生物学、分子克隆、基因诊断、法医学、考古学等各个领域。PCR扩增DNA片段的原理PCR是在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，整个扩增过程分三步：①变性：加热，模板DNA形成两条单链②退火：降温，模板单链DNA与引物配对结合③延伸：在DNA聚合酶及镁离子等存在的条件下，引物3'-端向前延伸，合成与模板配对的新链上述三

3、步为一个循环，经过一个循环DNA量增加一倍。新合成的链又可以成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后目的DNA就可以扩增106~109倍。通过循环可以提高PCR的特异性。PCR反应体系的组成及功能一个完整的PCR反应体系应包括以下成分：引物：是预扩增DNA片段两端的已知序列，是保证PCR特异性的关键因素，PCR引物设计的原则：1~7；目的是提高扩增的效率与特异性。终浓度为0.1~0.5umol/L引物设计的一般步骤及其原则获取目的基因序列，http://www.ensembl.org/或者http://www.genom

4、e.ucsc.edu采用引物设计软件如Primerpremier5.0、Oligo6.0获取适合于该目的基因的所有可能的引物集。按照下列原则挑选出你认为最合适的引物。①一般评分大于80②扩增产物长度以200-500bp为宜，③G+C的含量在40~60%之间，正向引物、反向引物以及内参引物的G+C含量和Tm值应接近④引物长度一般18~27bpATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。3`端第一个碱基尽量不要是A，也不要出现3个以上的连续碱基序列，如GGG等，3`端与模板严格配对。尽量减少发夹结构和引物二聚体

5、的形成，特别是在引物的3`端Primer5’未端可修饰、突和增加额外碱基（限制性核酸内切酶识别位点），但绝不可以在3‘端进行这些改造。RT-PCR两引物间序列要跨一个内含子设计好后对引物进行数据库blast，应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'外切酶活性，而无3'→5'外切活性，它不具有Klenow酶的3'→5'校对活性.因而，在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功能的.TaqDNA聚合酶的碱基错配机率为2.1×10-4.其活性对Mg

6、2+浓度非常敏感终浓度一般为：2.5u/100ul模板DNA相对于分子克隆、酶切、连接、标记等，PCR对DNA模板纯度的要求并不严格。模板用量也是很低的，一般认为102~104拷贝模板就可以满足要求。dNTP(dATPdCTPdGTPdTTP)已有商品化的混合液，终浓度一般为20~200umol/L。10×PCR反应buffer：已作成商品化的产品，它包括：250~500mmol/LKCl；100~500mmol/LTris-HCl（pH8.4）；15~20mmol/LMgCl2（对Taq酶的活性影响很大，一般浓度为1.5

7、~2.0mmol/L，实际应用时根据反应体系的情况进行调整。）；0.1%明胶或牛血清白蛋白ddH2O调节反应体积液体石蜡油（PCR仪有热盖则不用加）影响PCR的主要因素①PCR反应体系的各个组分②PCR循环的温度（预变性、变性、退火、延伸）③PCR循环的次数和平台效应④操作环境平台效应及其原因实验一PCR常用的PCR反应体系：10×PCRBuffer5ul上下游引物（25μM）2uldNTPs（2.5mM）4ulTaqDNA聚合酶0.5ul（2U）模板DNA0.1至1ugddH2O补足体积至50ul实验试剂：2×PCRMi

8、x:Taq酶，四种dNTP，PCR反应buffer引物：上下游特异性引物水（ddH2O）：用以补足体积基因组DNAcDNA实验操作及注意事项建立PCR反应体系1.扩增β-actin基因β-actin引物2lcDNA4l2×PCRMix15l水9ltotalvolume