TAGLN2通过活性Rac1抑制Hippo信号通路促进食管鳞癌转移

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1、OVEREXPRESSIONOFTAGLN2PROMOTESMETASTASISOFESOPHAGEALSQUAMOUSCELLCARCINOMAVIAINHIBITIONOFHIPPOSIGNALINGPATHWAYBYRAC1ACTIVATIONThesisSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineByDan-NiSunSupervisor:Prof.Yi-JunQiJune，2018摘要背景食管

2、癌（esophagealcancer，EC）是最常见的消化道恶性肿瘤之一，中国是EC高发地区之一，其死亡率位居所有癌症相关死亡原因的第四位。EC发病率和死亡率具有明显的地域性特征，我国华北太行山脉地区是EC高发区之一。EC常见的组织学类型包括：食管鳞状细胞癌（esophagealsquamouscellcarcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophagealadenocarcinoma，EAC），亚洲国家ESCC占所有EC90%以上。由于在诊断和治疗EC时，缺乏高特异性和高敏感性的诊断标志物以及有效的治疗手段，ESCC病人的五年生存率仅为10%。目前，外科手术是治疗ESCC

3、的主要手段，但是由于多数ESCC患者在确诊时已发展至中晚期，治疗手段有限。尽管临床上联合使用了放疗、化疗及生物治疗等综合治疗手段，但是中晚期ESCC病人的生存期并未有明显改善，因此，找寻高特异性和高敏感性的诊断标志物和潜在的分子治疗靶点是目前亟待解决的问题。TAGLN2（transgelin-2，肌动蛋白结合蛋白2）是一种重要的肌动蛋白结合蛋白，分子量为23kDa，定位于染色体1q2l-q25，广泛表达于全身各种组织器官，可通过结合肌动蛋白对细胞骨架的三维网状结构进行调节，从而直接参与生物学功能调控。近年研究发现TAGLN2异常表达见于多种肿瘤，如：在结直肠癌、肺癌、卵巢癌、胃癌

4、、宫颈癌和头颈癌中高表达，但在乳腺癌、肝细胞癌及食管腺癌中低表达。在亚细胞水平上，TAGLN2可出现在细胞膜、细胞质和细胞核中，且其在不同病理生理状态下存在细胞内分布差异。因此，TAGLN2表达异常与多种恶性肿瘤疾病的发生发展密切相关，可能是一个特异性肿瘤标志物和潜在的分子治疗靶点之一。Hippo信号通路在调控机体器官大小、组织再生和肿瘤等多种疾病的发生发展中发挥着重要作用。研究表明YAP/TAZ具有癌基因功能，是Hippo信号通路下游的辅助转录因子，Hippo信号通路的失活能够诱导YAP/TAZ介导的靶基因激活，参与肿瘤的发生发展过程。大量研究表明：在肝癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌

5、和前列腺癌等多种类型的癌症中，高表达YAP主要定位于细胞核。本课题组前期研究结果已证实：ESCC中TAGLN2高表达，其表达与ESCC的TNM分期呈正相关，与ESCC术后五年生存率呈负相关，并且是ESCC术后生存期的独立危I险因素之一。在此基础上，本研究分别在高表达TAGLN2的ESCC细胞系EC9706、NE6-T和低表达TAGLN2的食管上皮永生化细胞NE6中，应用慢病毒载体介导的RNAi靶向沉默TAGLN2表达或慢病毒载体介导TAGLN2过表达，阐明TAGLN2沉默或过表达对ESCC细胞恶性生物学行为的作用及其相关的分子机制。目的ESCC细胞中沉默TAGLN2或食管上皮永生

6、化细胞中过表达TAGLN2，检测TAGLN2对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，探讨TAGLN2促进ESCC恶性演进的分子机制，为ESCC诊断和靶向治疗奠定理论基础。方法构建shTAGLN2慢病毒载体和TAGLN2慢病毒过表达载体，分别转染高表达TAGLN2的ESCC细胞系EC9706、NE6-T和低表达TAGLN2的食管上皮永生化细胞NE6，嘌呤霉素筛选得到TAGLN2沉默亚细胞系EC9706shTAGLN2、NE6-TshTAGLN2和TAGLN2过表达亚细胞系NE6TAGLN2，Westernblot验证TAGLN2的沉默效果和过表达效果，然后采用细胞增殖实验、细胞迁移实验、

7、细胞划痕实验、细胞侵袭实验和肺转移实验检测TAGLN2沉默或过表达后对细胞增殖能力、迁移能力和侵袭能力的影响；Westernblot、明胶酶谱实验、RT-PCR和免疫荧光检测上述TAGLN2沉默和过表达亚细胞系中EMT相关分子和MMPs的变化；Westernblot、免疫荧光检测Hippo信号通路在TAGLN2促进ESCC演进过程中的变化特征；应用特异性Rac1抑制剂NSC23766抑制Rac1的活性后对Rac1-GTP高表达的NE6TAGLN2细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，及