实验四尼龙固定化木瓜蛋白酶

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1、实验七尼龙固定化木瓜蛋白酶（黄色字体不用抄）一.目的和要求1、学习和理解尼龙固定化木瓜蛋白酶基本原理。2、熟练掌握尼龙固定化木瓜蛋白酶基本技术。进一步理解其和水溶性酶比较所独有的优点。二.实验原理通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性的载体结合，固定在载体上，在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。酶的固定化方法有：吸附法（物理吸附、离子吸附）、包埋法、共价键结合法、交联法。本实验尼龙同定化木瓜蛋白酶属共价键结合法。尼龙长链屮的酰胺键，经HC1水解后，产生游离的-NH基，在一定条件下与双功能试剂戊二醛中的•一个-CHO

2、缩合，戊二醛的另一个-CHO则与酶巾的游离氨基缩合，形成尼龙（载体）一戊二醛（交联剂）一酶，即尼龙固定化木瓜蛋白酶。三.实验材料、试剂及仪器3.1材料尼龙布（86）或（66）,1000,剪成3X3cin3.5mol/LHC1溶液（每组30mL）0.2mol/L硼酸缓冲液（pH8.4）（每组30mL）5%戊二醛（以0.2mol/LpH8.4硼酸缓冲液配制，每组30mL）0.lmol/LpH7.2磷酸缓冲液（每组250mL）0.5mol/LNaCl溶液（用0.lmol/LpH7.2磷酸缓冲液配制）（每组150mL）木瓜蛋白酶溶液（lmg

3、/mL,用0.lmol/LpH7.2磷酸缓冲液配制）（每组15mU:分别称取50mg木瓜蛋白酶粉末五组，每组编号为A、B、C、D、E,分别加0.5mL激活剂，分别研磨2min、6min、lOmin、14min、18min,用0.lmol/LpH7.2磯酸缓冲液溶解，定容至50mL。激活剂（用0.lmol/LpH7.2磷酸缓冲液配制，含半胱氨酸lOmmol/L，EDTAlmmol/L）（每组50mL）。3.2试剂（1）甲醇溶液（含18.6%03（12和18.6%水）（每组50mL）（10）20%三氯乙酸（用蒸馏水配制）（每组40mL）

4、3.3仪器恒温水浴锅，紫外分光光度计，冰箱。n.实验步骤4.1固定化酶的制备（1）每组取5块尼龙布洗净，凉干。用含18.6%CaCh和18.6%水的甲醇溶液在50°C下保温10秒钟左右，并轻轻搅拌至尼龙布发粘，取出用水冲去污物，用吸水纸吸干。（2）尼龙布用3.5mol/LHC1在室温水解45min,用水洗至pH中性。（3）尼龙布用5%戊二醛在室温下浸泡偶联20mino（4）取出尼龙布，川0.lmol/LpH7.2磷酸缓冲液反复洗去多余的戊二醛，吸干，立即用酶液（lmg/mL）在4°C下固定3.5h（酶液用量每块布为ImL）。（5）从

5、酶液屮取出尼龙布（保留残余酶液作测定用），用0.5mol/L的NaCl（用0.lmol/LpH7.2磷酸缓冲液配制）洗去多余的酶蛋白，即为尼龙同定化酶。4.2酶活力测定（1）溶液酶活力测定取0.2mL酶液，加入1.8mL激活剂，37°C预热10min，加入37°C预热10min的1%酪蛋白溶液ImL,准确反应10min，加入20%三氯乙酸2mL反应终II:酶反应。对照管先加入20%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它与测定管相同。过滤，清液于280nm波讼下测定光吸收值（表11-1）。在上述条件下，每lOmin增加0.001个光吸收值

6、为1个酶单位（U）（以下同）。试剂溶液酶固定化酶残留酶CK12CK12CK12激活剂（mL）1.81.81.82.02.02.01.81.81.8酶液/固定化酶（mL或块）0.20.20.21块1块1块0.20.20.237V保温5min37°C1%酪蛋白(inL)—11-11—1137°C反应10min20%TCA222222222农111酶活力测定（mL）,摇匀1%酪蛋白111(inL)过滤八280nm（2）残留酶活力测定同溶液酶活力测定。（3）固定化酶活力测定取一块尼龙布固定化酶，加入2.0mL激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同

7、。五.数据处理及计算活力回收=（固定化酶总活力数/溶液酶总活力数）X100%相对活力=［固定化酶总活力数/（溶液酶总活力数一残留酶活力数）］X100%六.注意事项6.1尼龙布的处理是实验成败的关键，既要让其充分的活化，又不能使其破碎。6.2同定化酶液浓度最好为0.5-1mg/mL,每块尼龙布用量不宜超过1mL。6.3酶活性测定的反应时间一定要准确。6.4过滤操作要规范。