应用固定化木瓜蛋白酶制备大豆肽的研究

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1、万方数据2009年3月第24卷第3期中国粮油学报JournaloftheChineseCerealsandOilsAssociationV01．24，No．3Mar．2009应用固定化木瓜蛋白酶制备大豆肽的研究曹玉华汪海峰杨慧萍王肇慈(南京财经大学食品科学与工程学院，南京210003)摘要以壳聚糖为载体，用戊二醛交联将木瓜蛋白酶固定化，研究水解大豆分离蛋白制备大豆肽的工艺条件，结果表明：固定化木瓜蛋白酶的表观米氏常数为8．9nmg／mL。固定化木瓜蛋白酶的最适温度为55℃，最适pH为7．8，最佳底物浓度为2．0。3．0mg／mL，大豆分离蛋白的最佳流速为0．2m1．／min

2、，大豆分离蛋白的水解率达到42．6％，酶解液中大豆肽含量为1．453mg／mL。酶解液多肽分子质量大部分在10ku以下。关键词木瓜蛋白酶固定化酶酶水解大豆肽中图分类号：TS2文献标识码：A文章编号：1003—0174(2009)03—0113一04小分子大豆多肽，无论从理化特性、营养特性都显著优于大豆蛋白，而且具有生理活性，几乎可以渗透到人类生活的各个方面，是一种非常有前途的功能性食品原料，在食品工业和医药界具有十分广泛的用途，市场潜力巨大【l-4J。溶液酶的稳定性差，随着时间的延长，反映速度下降，只能采用分批生产，固定化酶可以提高酶的稳定性，控制酶反应过程，在较长时间内可

3、以进行反复分批的反应，提高酶的使用效率，对生产自动化、连续化等方面都十分有利，为酶的应用开拓了广阔的前景【5“J。对固定化木瓜蛋白酶流化床生物反应器制备大．豆肽的适宜条件，如pH、温度、底物浓度、流速等进行了系统研究，为其广泛应用提供了理论基础。1试验材料和仪器1．1试验材料木瓜蛋白酶：广西大学化学学院海发生物酶制品厂；固定化木瓜蛋白酶：自制；大豆分离蛋白：自制。1．2主要试剂与仪器干酪素：上海山浦化工有限公司；三氟乙酸、乙腈(色谱纯)：美国Fisher公司；戊二醛：武汉有机合成化工厂(按25％计)；三氯乙酸、冰乙酸、盐酸、氢氧化钠：南京化学试剂厂(分析纯)。LX3一型离心

4、机(4000r／rain)：上海医用分析仪收稿日期：2008一Ol一31作者简介：曹玉华，女，1970年出生，副教授，粮油深加工器厂；JB25一M型电动搅拌机：上海标本模型厂；UV2401型紫外分光光度计：SHlMADIUCORPORA—TION；1050型高效液相色谱仪：美国惠普；加热循环泵：德国Brabender；固定化酶流化床：自制。1．3试验方法1．3．1固定化酶的制备【7-9]以自制壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，将木瓜蛋白酶固定化。1．3．2固定化木瓜蛋白酶的表观米氏常数【10J称取固定化酶1～2g，精确至0．0002g，用磷酸缓冲液溶鳃，在45℃水浴中预热10r

5、ain，加入同样预热的1％酪蛋白溶液，准确反应10min，用4nM／L的盐酸终止反应(对照先加入盐酸，后加酪蛋白)，过滤，滤液于275nlTI波长下比色，lg固定化酶粉在一定的温度和pH条件下，1min水解酪素产生1腭酪氨酸为1个酶活力单位(U／g)。酶活的计算公式如下：X=A×K×8／2×1／10Xn×E式中：x为样品的酶活力；A为试样酶的平均酶活力；K为吸咣常数；n为稀释倍数；E为紫外法与福林法的换算系数(中性、碱性蛋白酶为0．5，酸性蛋白酶为O．77)。1．3．3固定化木瓜蛋白酶水解条件的测定将大豆分离蛋白溶液与缓冲溶液按一定比例混合均匀，在一定温度和一定pH值条件下

6、，控制一定的流速，使大豆分离蛋白流经固定化木瓜蛋白酶流化床生物反应器水解。万方数据114中国粮油学报2009年第3期1．4分析方法1．4．1氨基酸含量的测定——甲醛快速测定法L10J1．4．2大豆分离蛋白中总氮及可溶性氮的测定大豆分离蛋白中总氮的测定——凯氏定氮法，大豆分离蛋白中可溶性氮的测定——，I℃A法[11_12

7、。1．4．3水解度(DH)的测定【3JN．一N．DH=寻—詈×100％110一l’1式中：N2为大豆蛋白酶解液中10％TeA可溶性氮／IIlg；Nl为反应前蛋白液中10％TCA可溶性氮／mg；No为大豆分离蛋白中的总氮／rag。1．4．4酶解液中肽分子质量的

8、分布色谱条件为凝胶柱：TSI‘gelG3000SW，10胛，7．5nlnl×600mm；流动相：乙腈一0．1％，三氟乙酸=45：55；紫外检测波长：215nln。2结果与分析2．1固定化酶的选择不同的蛋白酶对蛋白质水解有各自的特异性和专一性，作用的部位因肽键而异。木瓜蛋白酶是一种重要的巯基蛋白酶，由212个氨基酸残基构成，能使蛋白质分解成多肽的水溶性蛋白质，作用的底物比较广泛，所以试验中选用木瓜蛋白酶来水解大豆分离蛋白。2．2固定化木瓜蛋白酶的表观米氏常数以0．10％、0．15％、0．20％、0．40％、0．60％